Вироиды

Симметричная и асимметричная репликация вироидов

Репликация вироидов осуществляется по механизму катящегося кольца, при котором на кольцевой РНК, используемой в качестве матрицы, синтезируются линейные мультимеры. РНК-полимераза клетки-хозяина синтезирует на кольцевой РНК, имеющей положительную полярность, одноцепочечную линейную комплементарную минус-цепь. Поскольку на РНК-матрице нет выраженных сигналов терминации для РНК-полимеразы, транскрипция может идти по кругу в несколько циклов, в результате чего образуется линейная мультимерная РНК[16].

У Avsunviroidae эти мультимерные РНК далее разрезаются на отдельные мономерные минус-цепи, которые замыкаются в кольцо. Такие кольцевые минус-РНК в дальнейшем служат для аналогичного процесса — синтеза мультимерных линейных плюс-цепей РНК, которые разрезаются на мономеры, замыкающиеся в кольцо. Такой цикл может давать несколько новых дочерних плюс-цепей РНК с исходной плюс-матрицы, поскольку и в первом, и во втором случае матрица транскрибируется больше, чем один раз. Такая репликация называется симметричной, потому что и плюс-, и минус-цепи реплицируются одинаково[16].

Члены семейства Pospiviroidae реплицируются по схожей схеме, однако у них линейные мультимерные минус-цепи, образующиеся в первом раунде транскрипции, не разрезаются на мономеры, а непосредственно копируются в линейные мультимерные плюс-цепи. Эти плюс-мультимеры далее разрезаются на мономеры, которые замыкаются в кольцо под действием ферментов клетки, давая дочерние кольцевые молекулы положительной полярности. Такая репликация называется асимметричной[16].

Описанный выше цикл репликации по типу катящегося кольца требует работы трёх ферментов:

1. РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая синтезирует мультимерные линейные цепи;
2. РНК-разрезающего фермента (эндорибонуклеазы), которая разрезает мультимерные цепи на линейные мономеры;
3. РНК-лигазы, которая замыкает линейные мономеры в кольцо[16].

Считается, что в репликации Pospiviroidae участвует клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза II (RNAPII), поскольку репликация этих вироидов блокируется при низких концентрациях α-аманитина, известного ингибитора этого фермента. Полимеризация у Avsunviroidae требует участия другого фермента, так как она не останавливается под действием высоких концентраций α-аманитина. Непосредственное доказательство участия РНК-полимеразы II в репликации вироидов было получено с помощью метода ко-иммунопреципитации вместе с доменом T_L вироида, однако роль каждой из субъединиц РНК-полимеразы II в этом процессе ещё предстоит установить[4]. Возможно, это различие связано с различными клеточными компартментами, в которых локализуются вироиды этих двух групп: вироиды семейства Pospiviroidae находятся в ядре клетки, а Avsunviroidae — в хлоропластах, находящихся в цитоплазме клетки-хозяина. РНК-полимераза хлоропластов похожа на бактериальную РНК-полимеразу в плане устойчивости к α-аманитину, так что, возможно, в хлоропластах вироиды реплицируются, используя РНК-полимеразу хлоропластов[17].

Клеточные РНК-полимеразы обычно транскрибируют только двуцепочечные ДНК-матрицы в РНК. Непонятно, каким образом вироиды рекрутируют эти РНК-полимеразы и заставляют их использовать свои одноцепочечные РНК-геномы в качестве матрицы для синтеза комплементарной РНК. В 2011 году были определены точки начала репликации и для Avsunviroidae, и для Pospiviroidae, так что, возможно, это поможет установить механизм рекрутирования вироидами РНК-полимераз клетки-хозяина[17].

Вторичная структура рибозима типа «головка молотка».

Вироиды семейства Avsunviroidae могут разрезать свои линейные мультимерные РНК на линейные мономеры in vitro в отсутствие белков. Такое разрезание молекулой РНК самой себя называется саморазрезанием, а молекулы РНК, способные к саморазрезанию, называются рибозимами, так как они способны проявлять ферментативную активность в отсутствие белков[17].

Реакция саморазрезания

Саморазрезание у РНК Avsunviroidae осуществляется при помощи структуры «головка молотка» (названной так за внешнее сходство), которая заставляет разрыв произойти в специфической фосфодиэфирной связи, связывающей нуклеотиды РНК. Другие саморазрезающие структуры РНК были определены также у сателлитных вироид-подобных РНК (шпильки) и вируса гепатита D (дельта-структура). Все эти структуры осуществляют разрыв за счёт спаривания с основаниями в других участках молекулы РНК. Показано, что эти структуры способны образовывать мономеры из мультимеров как in vitro, так и in vivo. Саморазрезание происходит посредством нуклеофильной атаки, осуществляемой 2'-гидроксилом нуклеотида, расположенного в месте разрыва. В результате по одну сторону разрыва образуется 2',3'-циклический фосфат, а по другую — свободный 5'-гидроксил[17].

Неизвестно, как разрезаются на мономеры мультимерные плюс-цепи Pospiviroidae: у них не было обнаружено способности к саморазрезанию. Было высказано предположение, что для этой цели могут использоваться клеточные ферменты[18]. В частности, предполагается, что мультимер может разрезаться на плюс-мономеры РНКазой III. В 2015 году было показано влияние Dicer-подобного белка 4 (DCL4), известного растительного белка с активностью РНКазы III, на накопление вируса веретеновидности клубней картофеля у табака Nicotiana benthamiana[4].

Лигирование у вироида латентной мозаичности персика (член семейства Avsunviroidae, локализуется в хлоропластах) может происходить без участия белков клетки-хозяина. Было показано, что линейные мономеры, образующиеся при саморазрезании мультимерных молекул посредством структуры «головка молотка», способны к самолигированию in vitro, образуя 3'→5'-фосфодиэфирные связи. По этой причине предполагается, что для репликации вироидам семейства Avsunviroidae необходима лишь РНК-полимераза клетки-хозяина, так как они способны к саморазрезанию и самолигированию без помощи белков[18].

Напротив, вироидам Pospiviroidae необходимы ферменты клетки-хозяина для осуществления всех этапов жизненного цикла: полимеризации, разрезания и лигирования. Показано, что РНК-лигаза проростков пшеницы, участвующая в сплайсинге интронов тРНК, может замыкать в кольцо линейные мономеры вироида веретеновидности клубней картофеля. Этот фермент, который образует 3'→5'-фосфодиэфирные связи, локализован в ядре, из-за чего представляется логичным кандидатом на роль фермента, осуществляющего лигирование РНК Pospiviroidae[18]. Впрочем, выяснилось, что и одна РНКаза способна замыкать в кольцо мономеры этого вироида в условиях in vitro. Другим возможным кандидатом на роль лигирующего фермента в жизненном цикле вироидов является ДНК-лигаза 1; возможно, в этом случае снова имеет место переключение фермента, работающего с ДНК, на РНК[4].

Наиболее вероятным способом передачи вироидов является передача через механические повреждения. Такой механизм передачи широко распространён среди патогенов растений. Инфекционный агент попадает в незаражённое растение при непосредственном контакте с заражённым, при использовании заражённых садовых инструментов, через семена, пыльцу или через насекомых-переносчиков (тлей или шмелей, однако такой способ передачи представляется сомнительным). Предполагается также возможность передачи вироида веретеновидности клубней картофеля вместе с вирусом скручивания листьев картофеля (род Polerovirus семейства Luteoviridae). В этом случае вироид может заключаться в вирусный капсид, так что образуется вирусная частица, содержащая внутри вироид. Это значительно облегчает распространение вироида и усложняет контроль его распространения[4].

Попав в новое растение, вироиды приступают к репликации и размножению, перемещаясь в другие клетки посредством межклеточных мостиков (плазмодесм). При вироидных инфекциях наблюдаются разнообразные симптомы, которые могут затрагивать как всё растение в целом, так и отдельные органы: листья, плоды, цветки, корни, органы запасания. К числу таких симптомов можно отнести обесцвечивание листьев, карликовость, появление оранжевых пятен, усиленное образование плодов, из которых лишь немногие созревают, и др.[18] На степень выраженности симптомов влияют последовательность и строение геномной РНК вироидов, состояние растения-хозяина и условия окружающей среды. Хозяевами могут быть травянистые и древесные растения, овощные и декоративные культурные растения. Некоторые растения могут служить бессимптомными носителями вироидов. Например, вироид веретеновидности клубней картофеля встречается в основном в декоративных растениях семейств Паслёновые (Solanaceae), Норичниковые (Scrophulariaceae) и Астровые (Asteraceae), у которых не вызывает каких-либо симптомов, однако у помидоров и картофеля он вызывает серьёзное заболевание. Возможно, что адаптация вироида к бессимптомным хозяевам вызвала малые изменения в его последовательности или структуре, что значительно увеличило степень выраженности симптомов[4].

Один из предполагаемых механизмов, лежащих в основе патогенности вироидов (через РНК-интерференцию)

Несмотря на крайнюю простоту строения, вызываемые вироидами болезни растений столь же разнообразны, как вызываемые вирусами растений. Так как вироиды не кодируют белков, их действие на растение должно быть следствием непосредственного взаимодействия вироидной РНК и содержимого клетки-хозяина. Анализ молекулярных химер, сконструированных из вироидов семейства Pospiviroidae с различной выраженностью патогенности, показал, что выраженность симптомов заболеваний зависит от сложных взаимодействий, в которых участвуют три из пяти доменов вироидной РНК. Изменения последовательности нуклеотидов в домене патогенности (P) может изменить инфективность вироида и степень выраженности симптомов. Например, некоторые мутации, усиливающие спаривание оснований в этом домене, снижают степень проявления симптомов[18].

Молекулярный механизм, с помощью которого вироиды вызывают заболевания у растений, остаётся невыясненным. Было высказано предположение, что первыми мишенями вироида являются и нуклеиновые кислоты, и белки клетки-хозяина. Геномы некоторых вироидов содержат участки, комплементарные некоторым клеточным РНК. В связи с этим предполагается, что заболевание начинается из-за ингибирования функций этих клеточных РНК или их разрезания, направляемого вироидной РНК (например, транс-разрезания структурой «головка молотка»). Например, последовательность части РНК вироида веретеновидности клубней картофеля имеет сходства с последовательностью РНК U1 млекопитающих (эта РНК участвует в сплайсинге), а некоторые вироиды могут комплементарно спариваться с 7S рРНК. Однако сложно объяснить, как изменение нескольких нуклеотидов может превратить высокопатогенный вироид в слабый, так как эти изменения обычно не располагаются в тех участках, которые, как предполагаются, гибридизуются с клеточными РНК[18].

Патогенность вироидов может также быть результатом мимикрии на молекулярном уровне. Из-за особенностей структуры или последовательности нуклеотидов вироидная РНК может замещать собой некоторые клеточные РНК. Так, были обнаружены гомологии между вироидом веретеновидности клубней картофеля и интронами I группы, а также РНК U3B, участвующими в сплайсинге РНК. Поэтому вироидные РНК могут мешать прохождению сплайсинга, замещая функциональные клеточные РНК в сплайсирующих комплексах[18].

В вироидном патогенезе также может быть задействована РНК-интерференция. Растения используют механизмы РНК-сайленсинга для защиты от вирусных инфекций. Ферменты клетки могут распознавать чужеродные двуцепочечные РНК или одноцепочечные РНК с развитой пространственной структурой и разрезать их на малые интерферирующие РНК (siРНК) длиной 21—26 нуклеотид. В заражённых растениях были выявлены малые РНК, идентичные участкам вироидной РНК, и показано, что эти siРНК образовались в результате работы ферментов клетки после проникновения вируса. Развитие симптомов вироидной инфекции может быть обусловлено активацией или отрицательной регуляцией клеточных генов-мишеней под действием siРНК, однако к настоящему моменту не было идентифицировано специфических генов-мишеней[19].

С другой стороны, возможно, существуют белки клетки-хозяина, которые распознают и взаимодействуют с различными вироидными структурами. Двуцепочечная РНК-зависимая протеинкиназа (PKR) млекопитающих активируется вироидом веретеновидности клубней картофеля, а её вторичная структура напоминает таковую двуцепочечной РНК. Была показана связь между уровнем активации этого фермента и степенью выраженности симптомов заболевания у растения. Активированная PKR фосфорилирует альфа-субъединицу эукариотического фактора инициации синтеза белка (eIF2), в результате чего происходит ингибирование синтеза белка в клетке. Активация растительного гомолога PKR может запускать вироидный патогенез, поскольку в клетках млекопитающих активность PKR индуцируется интерферонами и активируется двуцепочечной РНК[18].

Развитие вироидной инфекции может зависеть и от других белков клетки-хозяина. Взаимодействие белков клетки с вироидами чрезвычайно сложно, потому что высокая частота мутаций вироидов может оказывать значительное действие на их геномную последовательность и/или структуру. В 2003 году был открыт бромодомен-содержащий белок массой 65 кДа (VIRP1/BRP1), имеющий РНК-связывающий домен и предполагаемый сигнал ядерной локализации (NLS). Этот белок может взаимодействовать с доменом T_R вироида веретеновидности клубней картофеля (PSTVd) и в меньшей степени — вироида карликовости хмеля (HSVd). Показано, что у растений табака N. benthamiana и N. tabacum, у которых была подавлена экспрессия VIRP1, от PSTVd и вироида экзокортиса цитрусовых (CEVd) инфекция не развивалась. Эти данные, а также ядерная локализация белка свидетельствуют о его возможной роли в доставке вироида в ядро. Другим интересным примером взаимодействия вироида с белками клетки-хозяина является взаимодействие с очень многочисленным флоэмным белком, содержащим РНК-связывающий домен — РР2, лектин массой 49 кДа. Этот белок взаимодействует с различными молекулами РНК, в том числе HSVd (как in vitro, так и in vivo); предполагается, что он участвует в перемещении вироидов на дальние расстояния. Недавно открытый высокоструктурированный белок массой 30 кДа, Nt-4/1, может влиять на накопление и перемещение PSTVd. Стоит отметить, что непосредственное взаимодействие вироидов с такими белками, как гистоны, TFIIA и eIF1A, вовлекает вироиды в регуляцию хроматина, транскрипции и трансляции белков клетки-хозяина[4].

В 2016 году было показано, что вироид карликовости хмеля (HSVd) вызывает деметилирование генов рРНК в клетках листьев огурца, вызывая усиленное образование рРНК. Симптомы проявляются не только в строении спорофита, но и у гаметофита[20].

В таблице ниже кратко перечислены имеющиеся данные о взаимодействии вироидов с белками клетки-хозяина[4].

Явление кросс-защиты имеет место между различными штаммами одного вироида или вироидами с очень близкими геномными последовательностями. Растение, инфицированное одним вироидом, не даёт возможность реплицироваться и вызывать заболевание другому вироиду. Это напоминает вирусную интерференцию, при которой присутствие в клетке одного вируса подавляет репликацию другого вируса. Механизм кросс-защиты у вироидов неизвестен. Согласно одной из гипотез, для репликации, транспорта из клетки в клетку и накопления необходим ограниченный фактор хозяйской клетки. Различное сродство вироидных РНК к этому вироиду может определять, какой из вироидов, одновременно попавших в клетку, будет преобладать; кроме того, взаимодействие вироидной РНК с этим фактором может определять его патогенность[21].

Первым методом, который использовался для быстрой (в течение двух-трёх дней) идентификации растений, заражённых вироидами, был полиакриламидный гель-электрофорез (PAGE). Поскольку это — единственный диагностический метод, для работы которого нет необходимости знать последовательность генома вироида, PAGE в денатурирующих условиях и сейчас служит основным методом идентификации новых вироидов. С начала 1980-х годов для рутинной идентификации стал активно применяться метод гибридизационных точечных блотов, который постепенно вытеснил PAGE. Приблизительно через 10 лет для работы с вироидами стала применяться полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией[22][23].

Растительные сателлитные РНК — это небольшие одноцепочечные РНК, репликация и заключение в капсид которых зависит от вспомогательного вируса, с которым, однако, они не имеют или практически не имеют сходства последовательностей. Более того, сателлитные РНК не необходимы для репликации вспомогательного вируса, и большинство из них не кодируют каких-либо белков. Сателлитные РНК могут иметь линейную или кольцевую форму. Подобно вироидам, в структуре сателлитных РНК велико спаривание оснований. В отличие от вироидов, они имеют капсид и потому могут более эффективно передаваться от растения к растению. Более того, подобно Avsunviroidae, все вироид-подобные кольцевые растительные сателлитные РНК имеют структуры типа шпилек и головки молотка, которые катализируют разрезание мультимерных РНК на мономеры в ходе репликации по типу катящегося кольца[21].

Ряд РНК-содержащих вирусов растений поддерживает репликацию сателлитных РНК, предположительно, давая собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу для репликации сателлитных РНК и капсидные белки для формирования капсида сателлитных РНК. Присутствие сателлитных РНК может оказывать влияние на репликацию соответствующего вспомогательного вируса и модулировать симптомы вызываемого им заболевания. Судя по имеющимся сходствам, вироиды и вироид-подобные сатиллитные РНК произошли от общего предка[21].

Вирус гепатита дельта (HDV) — уникальный патоген человека, который имеет ряд общих черт с вироидами и вироид-подобными сателлитными РНК растений. Было высказано предположение, что HDV произошёл от примитивной вироид-подобной РНК через захват клеточного транскрипта. Этот патоген, передающийся с кровью, реплицируется в печени и часто вызывает скоротечный гепатит у приматов и других млекопитающих. Вирус гепатита дельта также может быть связан с развитием рака печени. Он обнаруживается только в присутствии вируса гепатита B и использует белок оболочки вируса гепатита B (S-антиген) для упаковки своего генома, представленного РНК. Поскольку вирусу гепатита дельта необходим вирусный белок для упаковки, он считается РНК-сателлитом вируса гепатита B. По всему миру этим патогеном заражено более чем 15 млн людей, поэтому гепатит, вызываемый вирусом гепатита дельта, представляет собой серьёзную проблему для здравоохранения[21].

Ретрозимы — группа малых неавтономных ретротранспозонов, распространённых в геномах растений и содержащих рибозим типа «головка молотка». Ретрозим представляет собой самовырезающуюся молекулу РНК, содержащую две длинные концевые области повторов длиной около 300 п. о., в каждой из которых находится рибозим типа «головка молотка». Именно они отвечают за способность к самовырезанию, опосредуя вырезание молекулы РНК длиной от 600 до 1000 п. о., которая не кодирует белков. Ретрозимы активно транскрибируются, давая начало разнообразным линейным и кольцевым молекулам РНК, которые накапливаются по-разному в разных тканях растения и на разных стадиях развития. Последовательности ретрозимов чрезвычайно вариабельны и не проявляют никакой гомологии, кроме наличия рибозимов и концевых повторов, присущих всем ретротранспозонам. Ретрозимы дают начало РНК различной полярности, что подтверждает наличие у них репликации РНК по типу катящегося кольца, такой как у вироидов. Функции ретрозимов в растительных геномах неизвестны[24].