ПЦР с обратной транскрипцией

В молекулярной биологии метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (англ. reverse transcription polymerase chain reaction) принято обозначать как ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR). ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК).[1]

Запрос «RT-PCR» перенаправляется сюда; если вас интересует ПЦР в реальном времени (Real-time PCR), или количественная ПЦР (quantitative PCR), см. ПЦР в реальном времени.
ОТ-ПЦР

Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции (ОТ, англ. RT, reverse transcription) в комплементарную ДНК (cDNA) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР. RT-PCR не следует путать с ПЦР в реальном времени (англ. Real-time PCR, Q-PCR), которую также иногда неверно сокращают как RT-PCR.[2]

Описание метода

Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу:

  • 1. Реакция первой цепочки:
    Комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C.
  • 2. Реакция второй цепочки:
    После того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР.

После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.[2]

Применение

ОТ-ПЦР используется для обнаружения молекул РНК в образце с заранее известным участком последовательности, комплементарным праймеру. Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК.

Примером являются РНК-вирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), который является ретровирусом и поэтому использует фермент обратную транскриптазу ВИЧ (англ. HIV-Reverse Transcriptase) для синтеза вирусной ДНК, которая затем встраивается в геном хозяина.

Также ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов[3].

См. также

Примечания
  1. Hunt M. (2006) Real time PCR tutorial - Copyright 2006, The Board of Trustees of the University of South Carolina
  2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.
  3. Bustin S. A. Journal of Molecular Endocrinology, 25 // Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays (англ.). — 2000. — P. 169—193.

Литература
  • Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.