Иммунопреципитация

Иммунопреципита́ция — метод выделения белка из сложных смесей, таких как клеточные лизаты, сыворотки и тканевые гомогенаты, при помощи специфичных к белку антител. Иммунопреципитация позволяет детектировать изменения экспрессии белка, характеризовать белки, с которыми исследуемый белок образует комплекс, выявлять сайты связывания белка с нуклеиновыми кислотами[1].

Методология

При проведении иммунопреципитации антитела связывают на микрогранулах. Чаще всего используются микрогранулы из агарозы. Также могут быть использованы микрогранулы, обладающие магнитными свойствами. При помощи магнита магнитные микрогранулы, несущие комплексы антиген-антитело, могут быть удержаны в пробирке во время удаления из неё не связавшихся с антителом компонентов образца[1].

В зависимости от способа связывания антител на микрогранулах, различают три технологии иммунопреципитации. В классической технологии применяются микрогранулы, покрытые белком A или белком G. Белок A, как и белок G, может связываться с Fc-областью широкого спектра антител. Антитело, специфичное к выделяемому белку, инкубируют со смесью, из которой планируют выделить данный белок. После образования комплекса выделяемого белка (антигена) с антителом в смесь вводят микрогранулы, покрытые белком A или белком G. Комплексы антиген-антитело связываются на микрогранулах. При помощи центрифугирования и промывки, микрогранулы со связанными комплексами антиген-антитело отделяют от смеси. Антиген и антитело элюируют с микрогранул. Иногда в смесь вводят микрогранулы, с которыми были предварительно связаны антитела. Основной недостаток классической технологии заключается в том, что при элюции выделяемого белка с микрочастицы антитело также будет снято с микрочастицы. В результате, выделяемый белок будет загрязнен, и антитела нельзя будет использовать повторно[1].

Загрязнения выделяемого белка и потери антител можно избежать путём иммобилизации антител на микрочастице. Существует две технологии: иммобилизация за счёт ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G, расположенного на поверхности микрочастицы, и иммобилизация за счёт образования ковалентной связи между антителом и материалом микрочастицы. Эти технологии также имеют свои недостатки. Недостаток ковалентной сшивки антитела и белка A или белка G заключается в том, что сшивающий реагент может образовывать ковалентные связи в произвольных участках антитела, повреждая активный центр, и, как следствие, антитело теряет способность связывать антиген. Недостаток ковалентной сшивки антитела и материала микрочастицы состоит в том, что, в отличие от технологий с использованием белка A или белка G, произвольный участок антитела свяжется с микрочастицей, что может привести к потере способности антитела связывать антиген[1].

В ситуации, когда антитела к выделяемому белку недоступны, к нему, с использованием генно-инженерных методов, может быть пришит тег (например, FLAG-тэг), к которому антитела доступны[2].

К достоинствам иммунопреципитации стоит отнести то, что в этом методе антигены взаимодействуют с антителами в их нативной конформации для дальнейшего разделения и количественного анализа. Более того, метод иммунопреципитации позволяет концентрировать белок. Недостаток метода состоит в том, что для эффективного обнаружения белок должен быть радиоактивно мечен[3].

Разновидности иммунопреципитации
Принцип ChIP-seq

Ко-иммунопреципитация
Ко-иммунопреципитация

Ко-иммунопреципитация (Co-IP) — это иммунопреципитация целого белкового комплекса, которая основана на использовании антитела, специфичного к одному из белков, входящих в состав комплекса. Связывая этот белок, антитело связывает весь комплекс. В результате появляется возможность идентифицировать все белки, входящие в состав комплекса[1].

Иммунопреципитация хроматина

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) — метод нахождения сайтов связывания исследуемого ДНК-связывающего белка в геноме. Для этого ДНК выделяют из клетки и режут на небольшие фрагменты, а затем проводят иммунопреципитацию, используя антитела к исследуемому ДНК-связывающему белку. В результате с антителами связываются комплексы, состоящие из исследуемого ДНК-связывающего белка и фрагмента ДНК. Такие фрагменты ДНК и есть сайты связывания исследуемого ДНК-связывающего белка в геноме. Для чтения нуклеотидной последовательности данных фрагментов ДНК используют ДНК-микрочипы (ChIP-on-chip) или современные методы секвенирования (ChIP-seq)[4][5].

Иммунопреципитация РНК

Иммунопреципитация РНК (RIP) — метод, позволяющий идентифицировать молекулы РНК, взаимодействующие с исследуемым РНК-связывающим белком, и определять сайты связывания исследуемого белка с молекулами РНК. Процедура иммунопреципитации РНК аналогична иммунопреципитации хроматина. Для чтения нуклеотидной последовательности выделенных фрагментов РНК используют ДНК-микрочипы, предварительно получив комплементарные выделенным фрагментам молекулы ДНК (RIP-chip), или современные методы секвенирования (RIP-seq)[6].

Примечания
  1. Kaboord B., Perr M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. (англ.) // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). — 2008. — Vol. 424. — P. 349—364. — doi:10.1007/978-1-60327-064-9_27. — PMID 18369874.
  2. Brizzard B. L., Chubet R. G., Vizard D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution. (англ.) // BioTechniques. — 1994. — Vol. 16, no. 4. — P. 730—735. — PMID 8024796.
  3. Stephen Thompson. Immunoprecipitation and Blotting // Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine™. — 2004. — Vol. 94. — P. 33—45. — doi:10.1385/1-59259-679-7:33.
  4. Hoffman B. G., Jones S. J. Genome-wide identification of DNA-protein interactions using chromatin immunoprecipitation coupled with flow cell sequencing. (англ.) // The Journal of endocrinology. — 2009. — Vol. 201, no. 1. — P. 1—13. — doi:10.1677/JOE-08-0526. — PMID 19136617.
  5. Lee T. I., Johnstone S. E., Young R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. (англ.) // Nature protocols. — 2006. — Vol. 1, no. 2. — P. 729—748. — doi:10.1038/nprot.2006.98. — PMID 17406303.
  6. Keene J. D., Komisarow J. M., Friedersdorf M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. (англ.) // Nature protocols. — 2006. — Vol. 1, no. 1. — P. 302—307. — doi:10.1038/nprot.2006.47. — PMID 17406249.

Литература
  • Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. Молекулярная биология клетки / Перевод с английского А. Н. Дьяконовой, А. В. Дюбы и А. А. Светлова. Под ред. Е. С. Шилова, Б. П. Копнина, М. А. Лагарьковой, Д. В. Купраша.. — М.—Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2013. — Т. 1. — С. 663—665. — 1052 с. — ISBN 978-5-4344-0137-1.

Ссылки

This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.