BRAF

Домен CR1 аутоингибирует киназный домен CR3 белка и является, таким образом, скорее регулирующим, чем структурным доменом[7]. Участок белка человека 155–227[9] является Ras-ГТФ-связывающий участком, который при связывании с Ras-ГТФ, который при связывании с CR1 высвобождает последний и снимает аутоингибирование киназы. Последовательность 234–280 содержит мотив цинковый палец, который связывается с форболовым эфиром или диацилглицерином и участвует в закреплении B-Raf на клеточной мембране после связывания с Ras[9][10].

Домен CR1 обеспечивает подвижное шарнирное соединение между доменами CR1 и CR3 и действует как шарнир[7].

Домен CR3 киназы B-Raf в неактивной конформации. P-Петля (оранжевый цвет) взаимодействует за счёт гидрофобных связей с активирующей петлёй (серый цвет), что стабилизирует неактивую конформацию. Фенилаланин (F595; показан красным цветом) блокирует гидрофобный пакет, в который встраивается аденин АТФ (жёлтый цвет). Аспарагиновая кислота D576 (показана оранжевым цветом) показана как часть каталитического центра фермента (показан фиолетовым цветом).

Домен CR3 (участок 457–717)[9] является ферментативным киназным доменом белка. Это исключительно консервативная структура[11], состоящая из двух долей, соединённых небольшим шарнирным участком[12]. Меньшая N-концевая доля домена (участок 457–530) отвечает в первую очередь за связывание АТФ, а большая C-концевая доля (участок 535–717) связывает белковый субстрат[11]. Активный центр фермента находится в углублении между долями и каталиатическая Аспарагиновая кислота D576 локализована на C-концевой доле и обращена внутрь междолевого углубления[9][11].

P-Петля B-Raf (участок 464–471) стабилизирует непереносящиеся фосфатные группу АТФ во время связывания фермента с АТФ. В частности серин-467, фенинлаланин-468 и глицин-469 формируют водородные связи с β-фосфатом АТФ для заякоривания молекулы АТФ. Функциональные мотивы киназного домена B-Raf были определены с помощью анализа их гомологии с протеинкиназой A[11].

Нуклеотид-связывающий пакет (V471, C532, W531, T529, L514 и A481) - гидрофобный пакет внутри которого аденин АТФ заякорен за счёт ван-дер-ваальсовых связей после связывания АТФ[11][13].

Каталитический центр включает участок 574–581, который обеспечивает перенос γ-фосфата АТФ от B-Raf на его белковый субстрат. В частности D576 действует как акцептор протона при активации нуклеофильного кислорода в гидроксильной группе серина или треонина в молекуле субстрата, что обеспечивает реакцию переноса фосфата за счёт щелочного катализа[11].

Мотив DFG включает остатки D594, F595 и G596 и является критическим мотивом B-Raf для функционирования белка как в неактивном, так и в активном состоянии. В неактивной конформации белка F595 занимает нуклеотид-связывающий пакет и предотвращает вход АТФ в пакет, снижая вероятность катализа[8][13][14]. В активной конформации D594 связывает двухвалентный катион марганца, что стабилизирует β- и γ-фосфатные группы АТФ и ориентируя γ-фосфат для переноса на субстрат[11].

Петля активации включает участок 596–600, который образует сильную гидрофобную связь с P-петлёй в неактивной конформации киназы, запирая киназу в неактивном состоянии до тех пор пока активационная петля не фосфорилирована, что дестабилизирует эти связи за счёт присутствия отрицательного заряда. Это запускает переход киназы в активное состояние. В частности, L597 и V600 активационной петли взаимодействуют с G466, F468 и V471 P-петли, что сохраняет киназный домен в неактивном состоянии до фосфорилирования киназного домена[12].

В нормальном неактивном состоянии киназный домен CR3 заблокирован за счёт двух механизмов: аутоингибирование собственным регуляторным доменом CR1 и отсутствием пост-трансляционного фосфорилирования ключевых серина и тирозина в шарнирном регионе CR2. Во время активации B-Raf аутоингибирующий домен CR1 связывает эффекторный домен ГТФ-Ras в своём Ras-связывающем участке и, в результате, высвобождает каталитический домен CR3. Взаимодействие CR1-Ras в дальнейшем усиливается за счёт связывания цистеин-обогащённого субдомена с Ras и фосфолипидами клеточной мембраны[7]. В отличие от A-Raf и C-Raf, домен CR2 которых должен быть фосфорилирован по определённым гидроксильным группам определённых аминокислот, в B-Raf домен CR2 постоянно фосфорилирован по S445[18]. Это позволяет отрицательно заряженному фосфосерину немедленно отдалить киназный домен CR1 за счёт стерических и электростатических взаимодействий как только регуляторный домен отсоединён, освобождая киназный домен для взаимодействия с белками-субстратами.

После ухода аутоингибирующего регуляторного домена CR1 киназный домен CR3 должен перейти в АТФ-связанную активную конформацию. В неактивной конформации F595 в мотиве DFG блокирует гидрофобный аденин-связывающий карман, в то время как активирующая петля образует гидрофобное взаимодействие с P-петлёй, предотвращая связывание АТФ с АТФ-связывающим участком. После того, как активирующая петля фосфорилируется, отрицательный заряд фосфата дестабилизирует гидрофобное взаимодействие с P-петлёй. В результате активирующая петля меняет конформацию, вытягиваясь вдоль C-концевой доли киназного домена. В ход этого процесса она формирует взаимодействия стабилизирующего β-листа с β6-структурой. Одновременно фосфорилированный остаток подходит к лизину K507, формируя стабилизирующий солевой мостик и запирает активирующую петлю в этом положении. Мотив DFG меняет конформацию с активирующей петлёй, вызывая выход остатка F595 из аденин-связывающего участка в гидрофобный карман, расположенный рядом с альфа-спиралью. В результате этих перемещений мотива DFG и активирующей петли фосфорилирование открывает АТФ-связывающий участок. Поскольку субстрат-связывающий и каталитический участки уже находились на своём месте, фосфорилирование активирующей петли само по себе активирует киназный домен B-Raf за счёт описанной цепной реакции, которая фактически открывает крышку готового активного центра[12].

Катализируемая основанием нуклеофильная атака остатков серина или треонина на молекуле субстрата на γ-фосфатную группу АТФ:
Этап 1. Хелирование двухвалентного катиона Mg остатком киназы N581 и депротонирование гидроксильной группы серина или треонина субстрата остатком киназы D576.
Этап 2. Нуклеофильная атака активированной гидроксильной группы субстрата на γ-фосфатную группу АТФ.
Этап 3. Комплекс с Mg распадается и D576 депротонируется.
Этап 4. Выход продуктов.

Для эффективного катализа фосфорилирования белка через бимолекулярный обмен остатков серина и треонина с АДФ в качестве уходящего продукта реакции B-Raf должен сначала связать АТФ, а затем стабилизировать промежуточное состояние в то время как γ-фосфат АТФ переносится[11].

B-Raf связывает АТФ за счёт заякоривания аденинового нуклеотида в неполярном кармане и ориентирует АТФ за счёт водородных связей и электростатических взаимодействий с фосфатными группами. В дополнение к P-петле и мотива DFG в стабилизировании непереносящихся фосфатных групп участвуют также остатки K483 and E501. Положительный заряд первичной амино-группы остатка K483 позволяет стабилизировать отрицательный заряд на α- and β-фосфатных группах АТФ, когда АТФ связывается с киназой. В отсутствии АТФ положительный заряд нейтрализуется отрицательным зарядом карбоксильной группы E501[11][12].

Когда АТФ связана с киназным доменом B-Raf, D576 каталитического центра фермента активирует гидроксильную группу белка-субстрата, увеличивая её нуклеофильность для запуска реакции фосфорилирования, тогда как прочие аминокислотные остатки каталитического центра стабилизируют промежуточное состояние. N581 хелирует двухвалентный катион магния, связанного с АТФ, помогая правильной ориентировке молекулы для оптимальной реакции замены. K578 нейтрализует отрицательный заряд на γ-фосфате АТФ таким образом, что активированный субстрат не подвергается электронному отталкиванию в процессе реакции с фосфатом. После переноса фосфатной группы полученные продукты реакции АДФ и фосфопротеин высвобождаются из каталитического центра фермента[11].

Поскольку мутантные формы постоянно активной киназы B-Raf приводят к развитию раковых опухолей из-за повышенного клеточного сигнала, направленного на рост клеток, ингибиторы как неактивной, так и активной конформаций киназного домена белка были разработаны как противоопухолевые препараты[12][13][14].

Киназный домен B-Raf, закрытый в своей неактивной конформации при связывании с ингибитором BAY43-9006. Гидрофобные взаимодействия заякоривают BAY43-9006 в АТФ-связывающем участке белка, в то время как мочевинная группа ингибитора за счёт водородных связей запирает остаток белка D594 в мотиве DFG. Трифторометилфенильное кольцо BAY43-9006 предотвращает перестройку мотива DFG и активирующей петли в активную конформацию благодаря их стерической блокировке.

BAY43-9006 (Сорафениб, в составе препарата Nexavar, Bayer AG) является ингибитором мутантной формы B-Raf V600E, одобренным FDA для лечения первичных злокачественных опухолей печени и почек. Ингибитор блокирует киназный домен B-Raf, запирая фермент в его неактивной форме. Ингибитор достигает этого, блокируя АТФ-связывающий карман за счёт высокой аффинности к киназному домену. Затем он связывается с активирующей петлёй и мотива DFG, останавливая переход этих участков в активное состояние. Наконец, трифторометилфенильная составляющая ингибитора стерически блокирует активирующую петлю и мотив DFG и делает невозможным их трансформацию в активную конформацию[12].

Дистальная пиридиновая группа ингибитора заякоривается в гидрофобном нуклеотид-связывающем кармане N-доли киназного домена, взаимодействуя с белковыми остатками триптофана W531 и фенилаланинов F583 и F595. Гидрофобные связи ингибитора с F583 каталитического центра фермента и F595 мотива DFG стабилизирует неактивную конформацию этих участков, снижая вероятность активации фермента. Последующие гидрофобные взаимодействия центрального фенильного кольца ингибитора с остатками K483, L514 и T529 фермента ещё более увеличивают аффинность ингибитора к киназному домену фермента. Гидрофобное взаимодействие остатка F595 с ингибитором также энергетически ещё больше снижает вероятность конформационного перехода DFG. Наконец, полярные взаимодействия ингибитора с киназным доменом далее повышают аффинность связывания ингибитора с ферментом и ещё более стабилизируют мотив DFG в его неактивном состоянии. Остатки E501 и C532 связываются водородными связями с остатком мочевины и пиридина в молекуле ингибитора, соответственно. Карбонильная группа остатка мочевины в молекуле ингибитора связывается водородной связью с азотом амида в остатке D594, что в результате полностью запирает мотив DFG[12].

Трифторометилфенильная группа цементирует термодинамическое предпочтение неактивной конформации при связывании киназного домена с ингибитором за счёт стерической блокировки гидрофобного кармана между αC- и αE-спиралей мотива DFG и активирующей петлёй, который должен бы быть задействован при переходе фермента в активную конформацию[12].

Структура вемурафениба (справа) и его предшественника PLX 4720 (слева), двух ингибиторов активной конформации киназного домена B-Raf.

PLX4032 (Вемурафениб) - ингибитор мутантной формы B-Raf V600E, одобренным FDA для лечения поздних стадий меланомы[8]. В отличие от сорафениба (BAY43-9006), который ингибирует неактивную форму киназы, вемурафениб ингибирует активную форму фермента на стадии активированного мотива DFG[13][14], прочно заякориваясь на АТФ-связывающем участке. Ингибируя только активную форму киназы, вемурафениб селективно ингибирует пролиферацию только клеток с нерегулируемой формой киназы B-Raf, которая приводит к образованию раковой опухоли.

Поскольку вемурафениб отличается от своего предшественника PLX4720 только фенильным кольцом, добавленным для улучшения фармакокинетики препарата[14], механизм действия обоих веществ одинаков. PLX4720 обладает высокой аффинностью к АТФ-связывающему участку киназного домена частично за счёт заякоривающего участка молекулы ингибитора бициклического 7-аза-индола, который отличается от естественного лиганда АТФ-связывающего участка аденина только тем, что оба атома азота аденина заменены на углероды. Это обеспечивает сохранение сильных межмолекулярных взаимодействий таких как водородные связи N7 с C532 и N1 с Q530. Кроме этого, стерическое совпадение с АТФ-связывающим карманом (C532, W531, T529, L514, A481) повышает аффинность ингибитора. Водородная связь кетоновой группы и совпадение дифторфенильной группы со вторым гидрофобным карманом (A481, V482, K483, V471, I527, T529, L514 и F583) также вносит вклад в высокую аффинность связывания ингибитора с киназным доменом B-Raf. Селективность вемурафениба к активной конформации B-Raf также повышается pH-зависимым депротонированием сульфаниламидной группы, которая связывается водородной связью с NH-группой пептидной связи D594 в активном состоянии B-Raf. Дело в том, что в неактивном состоянии киназы сульфаниламидная группа вемурафениба связывается с карбонильной группой пептидной связи остатка этой аминокислоты, что приводит к отталкиванию, поэтому вемурафениб предпочтительно связывается именно с активной конформацией киназного домена B-Raf[13][14].

У человека обнаружено более 30 различных мутаций гена, связанных с развитием злокачественных опухолей. Частота встречаемости мутации гена BRAF сильно различается в зависимости от типа опухоли: от более 80% при меланоме до 1-3% при лёгочной карциноме и 5% при колоректальном раке[20]. В 90% случаев, когда рак связан с мутацией BRAF, мутация вызвана заменой тимина на аденин в нуклеотиде 1799 гена. Это приводит к замене валина на глутаминовую кислоту в кодоне 600 (т.н. V600E) активирующего региона[21]. Эта мутация особенно часто наблюдается при папиллярной карциноме щитовидной железы, колоректальном раке, меланоме и немелкоклеточном раке лёгкого[22][23][24][25][26][27][28]. В 57% случаев мутация BRAF-V600E присутствует у больных гистоцитозом клеток Лангерганса[29].

Другие обнаруженные мутации: R461I, I462S, G463E, G463V, G465A, G465E, G465V, G468A, G468E, N580S, E585K, D593V, F594L, G595R, L596V, T598I, V599D, V599E, V599K, V599R, V600K, A727V и другие. Большинство этих мутаций локализованы в двух кластерах: в глицин-обогащённой P-петле N-концевой доли и в активирующем сегменте и соседних с ними регионах[12]. Эти мутации связаны с изменением активирующего сегмента из неактивного состояния в активное. Например, алифатическая цепь валина-599 взаимодействует с фенильным кольцом фенилаланина-467 в P-петле. Замена гидрофобного валина на крупные заряженные (как отрицательно-, так и положительно-заряженные) остатки при раке у человека (т.е. глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, лизин или аргинин) дестабилизирует взаимодействия мотива DFG в неактивной конформации, что приводит к переходу активирующего сегмента в активное состояние. В зависимости от мутации может меняться киназная активность B-Raf по отношению к различным митоген-активируемым киназом киназы (MEK). Большинство онкогенных мутаций повышают активность B-Raf. Другие вызывают рак за счёт другого механизма: хотя они могут снижать активность B-Raf, но приводят к конформационному изменению B-Raf, которая стимулирует киназу C-RAF, действующую через сигнальные пути ERK.

• BRAF V600E определяет чувствительность клеток к ингибиторам протеасом. Такая клеточная чувствительность к ингибиторам протеасомы зависит от наличия сигнала от B-Raf, поскольку блокировка BRAF V600E ингибитором PLX4720 возвращает клеточную чувствительность к анти-раковому препарату карфилзомибу в клетках колоректального рака, несущих мутацию BRAF V600E. Таким образом, ингибиторы протеасомы рассматриваются как возможная терапевтическая стратегия при этом раке с мутацией BRAF V600E[30].