Микотоксины

Диагностика заболевания основана на этиологических признаках, в сочетании с выявлением и идентификацией микотоксинов в кормах или тканях больного животного.

Нормативные документы ВОЗ на содержание микотоксинов:

• CAC/RCP 50. Code of Practice for the Prevention and Reduction of Patulin Contamination in Apple Juice and Apple Juice
• CAC/RCP 51. Code of Practice for the Prevention and Reduction of Mycotoxin Contamination in Cereals, including Annexes on Ochratoxin A, Zearalenone, Fumonisins and tricothecenes

В соответствии с системой ХАССП (анализ рисков и критические контрольные точки), путём идентификации и оценки риска, обусловленного наличием микотоксинов, в процессе производства и потребления зерна и комбикормов было выделено 7 критических контрольных точек, на которых необходимо предпринимать меры для предотвращения контаминации: (1) состояние и качество семян, (2) качество обработки почвы, (3) период прорастания, (4) уборка урожая, (5) период после уборки урожая, (6) хранение и (7) переработка. Для того чтобы избежать загрязнения зерна и кормов микотоксинами, необходимо тщательно придерживаться технологических норм в первых шести критических контрольных точках. Если загрязнение все-таки произошло, то следует принять меры по обеззараживанию (деконтаминации) зерна и кормовых субстратов до использования и по профилактике отравлений (микотоксикозов) животных при использовании токсичных кормов.

Процесс деконтаминации зерна представляет собой направленное воздействие физических, химических или биологических факторов (агентов), а также их комбинаций, в результате которого происходит деградация (разрушение) содержащихся в зерне микотоксинов. Зерно подвергают обработке деконтаминирующими факторами либо в сухом виде, либо в водной среде. В большинстве случаев второй подход оказывается более эффективным в силу того, что, во-первых, преобладающее количество реакций, ведущих к детоксикации, происходит в водной среде, во-вторых, в сухом субстрате микотоксины гораздо менее доступны для действия как физических, так и для химических агентов. Недостатком этого подхода является необходимость удаления остатков химических агентов, наличие которых в кормах нежелательно, и продуктов трансформации микотоксинов во избежание возможности обратных реакций и реакций активации. Кроме того, после завершения деконтаминации зерно необходимо высушить, что требует дополнительных энергетических затрат.

Это один из наиболее ранних приёмов по обеззараживанию зерновых продуктов. В основе метода детоксикации зерна путём вымачивания лежат два механизма: (1) экстракция водорастворимых микотоксинов и (2) трансформация ферментами, содержащимися в зерне. Многие микотоксины, молекулы которых содержат гидрофильные группы, эффективно экстрагируются водой. К таким микотоксинам относятся ДОН, ниваленол, НТ-2 токсин, Т-2 триол, Т-2 тетраол. Предложен метод обезвреживания фуражного зерна, согласно которому зерно заливают четырёхкратным объёмом воды и выдерживают, помешивая, 6 часов, после чего воду меняют. Таким образом, в течение суток процедуру повторяют четыре раза. Показано, что обработанная таким образом культура на зерне токсигенного штамма Fusarium sporotrichiella 5750 теряла присущую изначально способность вызывать образование некрозов на коже кролика[3].

Обработка аммиаком или монометиламином эффективна в отношении афлатоксинов, зеараленона и охратоксинов. Эфирные и лактонные группы, имеющиеся в составе молекул зеараленона и родственных ему соединений, а также охратоксинов и афлатоксинов, взаимодействуют с первичными и вторичными аминами, в результате чего образуются амиды, что коренным образом изменяет свойства молекул микотоксинов. Однако разрыв лактонного кольца при воздействии этих веществ происходит лишь при инкубации от получаса до нескольких часов в сильнощелочной среде, при температуре 100 °С и давлении от 3 до 10 бар. Установлено, что углеаммонийные соли (УАС) способны разрушать афлатоксины B1 и G1, а также Т-2 токсин с образованием Т-2 триола и Т-2 тетраола[4]. При концентрации УАС в зерне 8 % и экспозиции 4 недели концентрация афлатоксина B1 снижалась на 75 %, афлатоксина G1 на 94 %, начальные концентрации которых составляли 40 и 12 мг/кг, соответственно. УАС обладают сильным фунгицидным, бактерицидным и инсектицидным действием. В зависимости от вида и влажности зерна концентрация УАС должна составлять от 2,5 до 4,5 %. В этих концентрациях УАС не оказывают отрицательного воздействия на цыплят.

При контакте микотоксинов с окислителями происходит разрушение функциональных групп, обуславливающих токсические свойства. Образующиеся при этом метаболиты характеризуются высоким содержанием гидрофильных групп, вследствие чего легко вымываются из обрабатываемого субстрата.

Действующим началом гипохлорита натрия является активный (восстановленный) хлор и кислород. Сильно выраженные окислительные свойства делают ГХН эффективным дезинфицирующим и детоксицирующим средством. Разработан способ улучшения качества зерна и семян[5], который заключается в обработке зерна растворами ГХН. В зависимости от преследуемой цели, обработку осуществляют путём кратковременного погружения зерна в рабочий раствор, аэрозольного распыления раствора над поверхностью зерна или длительного вымачивания. Гипохлорит натрия используют в виде чистого раствора либо в смеси со щелочами, перекисью водорода, органическими растворителями (этанолом, этилацетатом) или органическими кислотами (уксусной, надуксусной). При вымачивании в течение 7 часов в щелочном 0,8 % растворе гипохлорита происходит снижение концентрации ДОНа, ниваленола, зеараленона, монилиформина, фумонизинов, охратоксина А, цитринина и патулина. В результате обработки повышается интенсивность естественной пигментации зерна (яркость) и снижается краснота, которая, как известно, обусловлена наличием пигментов плесневых грибов, многие из которых высокотоксичны, например, аурофузарин. Кроме того, значительно снижается процент семян, инфицированных фитопатогенными бактериями, в том числе родов Xanthomonas и Pseudomonas, и грибами родов Fusarium (F. graminearum, F. solani), Alternaria, Helminthosporium и т. п.

Эффективным окислителем микотоксинов является озон. Для деконтаминации зерна используют насыщенную озоном воду. При воздействии озона происходит деградация афлатоксинов B1, B2, G1 иG2, циклопиазоновой кислоты, фумонизина B1, охратоксина А, патулина, секаловой кислоты и зеараленона[6]. Вследствие мо-дификации озоном зеараленон теряет эстрогенную активность[7]. Обработка озоном естественно контаминированной афлатоксином кукурузы предотвращает развитие афлатоксикоза у индеек[8]. Показано, что трихотеценовые микотоксины тоже разрушаются при воздействии озона. Наиболее активно молекула озона атакует молекулу трихотецена по двойной связи между атомами С9 и С10, в результате чего образуются нестабильные промежуточные соединения, молозонид и озонид трихотеценов, с сопутствующим гидролизом связи С9-С10[9].

Микотоксины формируют разнородную по химическому строению группу соединений. Поэтому ферменты, обладающие способностью трансформировать микотоксины, являются представителями нескольких классов и подклассов и специфичны в отношении различных функциональных групп. Детоксикация микотоксинов происходит в результате действия ферментов, обладающих оксидоредуктазной, гидролитической (эпоксидгидролазы, карбоксилэстеразы, лактоногидролазы) и трансферазной (УДФ-гликозилтрансферазы) активностью.

катализируют гидролиз сложноэфирных связей, а эпоксидгид-ролазы — 12,13-епоксигруппы в молекулах трихотеценовых микотоксинов. Установлено, что именно эти два процесса осуществляются бактериями, населяющими кишечник кур[9]. Смеси микробов, изолированных из содержимого кишечника, способны трансформировать более 12 различных трихотеценовых микотоксинов. Ранее было установлено[10], что включение в корм для кур-несушек культуры штамма Escherichia coli, изолированного из толстого кишечника, приводило к увели-чению живой массы и яйценоскости на фоне Т-2 токсикоза, по сравнению с группой, по-лучавшей только Т-2 токсин; концентрация Т-2 токсина в корме составляла 8 мг/кг.

осуществляют конъюгацию микотоксинов с активиро-ванными формами глюкозы. В геноме Arabidopsis thaliana содержится более 100 генов, кодирующих различные изофомы этого фермента. Гены наиболее специфичных в отношении ДОНа УДФ-гликозилтрансфераз экспрессированы в клетках дрожжей[11]. Ферменты, полученные от трансформированных таким образом дрож-жей, эффективно разрушают ДОН, 3-ацетил-ДОН и 15-ацетил-ДОН, однако менее действенны в отношении остальных трихотеценовых микотоксинов. Такие дрожжи рекомендуют использовать в пивоваренной промышленности. Для деконтаминации зерна и комбикормов можно использовать как иммобилизованную УДФ-гликозилтрансферазу, так и продуцирующие её дрожжи.

превращают зеараленон в 1-(3,5-дигидрокси-фенил)-10’-гидрокси-1’-ундецен-6’-он, который не имеет эстрогенной активности. Из Clonostachys rosea изолирован ген zdh101, кодирующий лактоногидролазу. Этот ген удалось экспресси-ровать в клетках бактерии Escherichia coli, дрожжей Saccharomyces cerevisiae и культуре клеток риса[12]. Зеараленон эффективно ("100 %) трансформировался в средах с культурами E. coli и клеток риса, тогда как трансформированные дрожжи снижали содержание зеараленона в культуре на 75 %.

Из зерен кукурузы изолированы штаммы микроорганизмов — дрожжей Exophiala spinsfera и Rhinocladiella atrovirens, а также бактерий родов Xanthomonas и Sphingomonas, которые могли расти на средах, единственным источником углерода в которых были фумонизины[13]. Установили, что первой и ключевой реакцией процесса биодеградации фумонизина B1 является гидролиз эфирной связи с образованием трикар-баллилата и аминоспиртового производного, обозначенного АР1. Ферменту, осуществ-ляющему эту реакцию, дали название фумонизин гидролаза. Предполагают, что данный фермент относится к эстеразам, специфичным к эфирам трикарбаллилата. Ни одна из коммерческих эстераз не обладает подобной активностью. Тем же способом из кукурузного зерна выделены бактерии Ochrobactrum anthropi, которые в качестве единственного источника углерода могут утилизировать монилиформин[14]. Пока не известно, какие именно ферменты участвуют в детоксикации монилиформина, но полагают, что сначала происходит гидролиз двойной связи и разрыв кольца, а затем окисление. Предложен метод деконтаминации кукурузы, согласно которому кукурузу размалывают, заливают равным объемом взвеси бактерий с концентрацией клеток 106 в 1 мл и выдерживают в течение двух недель при комнатной температуре.

Метод основан на явлении ультразвуковой микрокавитации — локальном волнообразном образовании пор (пузырьков) с пониженным давлением и повышении давления до 100 кПа и температуры до 1700 °С. Высокочастотные колебания, сообщаемые обрабатываемому материалу ультразвуковыми волнами, способствуют эффективному высвобождению микотоксинов в раствор. Кроме физического воздействия, ультразвуковые волны запускают так называемые соно-химические реакции, отличающиеся по термодинамическим и кинетическим характеристикам от аналогичных реакций, протекающих в нормальных условиях, то есть в отсутствие ультразвукового воздействия. Зерно загружают в контейнеры, на стенках которых расположены генераторы ультразвука, заливают реакционной смесью и обрабатывают ультразвуком с частотой 35—100 кГц в течение 2—4 часов при температуре 12—50 °С. Данный метод позволяет снизить концентрацию Т-2 токсина, НТ-2 токсина, ДОНа, зеараленона, охратоксинов и афлатоксинов в зерне злаковых на 70—80 %[15]. Эффективно разрушается эпоксидная группа трихотеценовых микотоксинов, играющая, как известно, ключевую роль в механизме токсического действия. Гидролизу эпоксигруппы способствует сдвиг кислотно-основного равновесия, как в сторону снижения, так и в сторону повышения рН. Для защелачивания среды можно использовать карбонаты, а также первичные и вторичные амины. В роли катализаторов могут выступать спирты, например, метанол, этанол, пропанол, глицерин или полиэтиленгликоль. Кроме участия в сонно-химических реакциях трансформации микотоксинов, спирты, присутствующие в реакционной смеси, улучшают смачивание зерна и повышают растворимость микотоксинов и, следовательно, их экстракцию из зерна. После завершения ультразвуковой обработки, реакционную смесь сливают, а обработанное зерно промывают водой, при необходимости повторно подвергая воздействию ультразвука, и высушивают.

Профилактическое действие пробиотических препаратов при микотоксикозах базируется на двух основных принципах: (1) синтез ферментов, трансформирующих микотоксины до менее опасных продуктов (2) сорбция микотоксинов компонентами клеточной стенки. Кроме того, пробиотические микроорганизмы обладают способностью синтезировать ряд веществ, способствующих улучшению физиологического состояния животного организма и повышению продуктивных качеств. К таким веществам относятся органические кислоты, нормализирующие рН среды желудочно-кишечного тракта, антибиотики, подавляющие жизнедеятельность патогенных микроорганизмов, гидролитические ферменты, повышающие доступность питательных веществ кормов, и витамины.

Действие сорбентов основано на способности выводить микотоксины из желудочно-кишечного тракта. Сорбенты должны быстро связывать и эффективно удерживать микотоксины при различных уровнях кислотности. Негативным качеством сорбирующих материалов является низкая специфичность, вследствие которой происходит связывание питательных веществ (незаменимых жирных кислот, витаминов, аминокислот) и лекарственных препаратов. В рекламных статьях, которыми изобилуют издания научно-практического характера, можно встретить высказывания о том, что тот или иной препарат адсорбирует исключительно микотоксины и ничто иное. Однако одного взгляда на структурные формулы микотоксинов, относящихся даже к одному классу, не говоря уже о представителях различных групп, будет достаточно для того, чтобы подвергнуть сомнению подобное утверждение. Микотоксины — это группа разнородных по строению соединений, которые имеют два общих атрибута: во-первых, токсичность для животных, а зачастую и для представителей других царств, и, во-вторых, продуцентами микотоксинов, за редким исключением, являются плесневые грибы. Маловероятно, чтобы какой-либо адсорбент мог избирательно связывать химические соединения, объединенные в группу только по этим двум общим атрибутам, не отражающим их физико-химических свойств. Кроме того, сорбенты могут быть причиной механического повреждения эпителия кишечника, поэтому немаловажным критерием является их безопасность для животных.

Процесс разработки препаратов, содержащих сорбирующие материалы, должен включать три этапа: (1) исследование адсорбционной активности в отношении микотоксинов и питательных веществ in vitro; (2) опыты на животных по изучению профилактического эффекта препарата при введении в корм определенного микотоксина в различных концентрациях; (3) изучение профилактических свойств при скармливании животным корма, естественно контаминированного микотоксинами. В последнем случае необходимо провести максимально полный анализ корма на содержание микотоксинов. При проведении экспериментов на животных следует уделять внимание не только позитивным, но и негативным эффектам воздействия сорбентов.

В настоящее время известно, что для оптимального выбора сорбента нужно учитывать его полярность. Например, алюмосиликаты оказались активными только по отношению к полярным микотоксинам, в частности, к афлатоксинам. Микотоксини, не содержащие полярных групп, например, Т-2 токсин, фумонизины и зеараленон, адсорбируются полярными сорбентами менее эффективно. Исследователям не удалось предотвратить токсикозы птиц, вызываемые трихотеценами типа А — Т-2 токсином и диацетоксисцирпенолом — с помощью алюмосиликатов[16]. Для связывания гидрофобных микотоксинов целесообразно применять неполярные сорбенты, такие как активированный уголь. Способность активированного угля адсорбировать охратоксин А и Т-2 токсин достаточно эффективно проявляется при внесении его в корм в концентрации 5—10 %, однако установлено, что при этом адсорбируются также некоторые питательные вещества.

Наличие в составе молекулы гипохлорита натрия (ГХН) восстановленного хлора придает ему целый ряд уникальных свойств, проявляющихся в широком спектре действия на различные системы организма, среди которых антимикробное, антитоксическое, иммуномодулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое и проапоптическое.

Один из ключевых моментов целесообразности применения ГХН заключается в том, что он не является чужеродным для животного организма соединением. Известно, что гипохлорит-ион синтезируется клетками иммунной системы животного организма в процессе развития первичного иммунного ответа, который сопровождается воспалительными реакциями. Роль гипохлорита при этом заключается в обезвреживании токсинов патогенных бактерий и окислении токсичных остатков бактериальных клеток и поврежденных клеток организма. Кроме того, гипохлорит обогащает ткани кислородом и специфически влияет на активность генов, ответственных за развитие воспалительного процесса. Был проведен опыт по выпаиванию курам (возраст — 140 дней) раствора гипохлорита натрия при скармливании корма, содержащего 40-70 мкг/кг Т-2 токсина[4]. Численность групп: опыт — 1 672; контроль — 1 795. Опытной группе в течение 25 суток выпаивали раствор ГХН в концентрации 30 мг/л. По результатам эксперимента было установлено, что выпаивание раствора ГХН оказало положительное влияние на сохранность, количество яиц на начальную несушку и инкубационные характеристики яиц.

1. Управление на ферме: быстрая сушка, обеспечение условий хранения для предотвращения развития плесеней.
2. Анализ на выходе лущильной машины: экспресс-анализ проводится с помощью тонкослойной хроматографии, ИФА, ВЭЖХ.
3. Сортировка после лущения: обесцвеченные зародыши часто заражены грибами, поэтому автоматизированные сортировочные линии позволяют предотвратить попадание микотоксинов в корма для животных и продукты питания для людей.