Нетранслируемые области

Эффективность трансляции мРНК может быть различной, поэтому возможна регуляция количества получающегося белка. Это является важным механизмом регуляции экспрессии гена. Действительно, лишь для секретируемых белков существует чёткая связь между количеством мРНК и белка (чем больше мРНК, тем больше белка). У белков, предназначенных для внутриклеточного использования, эта взаимосвязь в значительной мере искажается различными темпами трансляции различных мРНК[18].

Структурные особенности 5'-НТО имеют важное значение для контроля трансляции. Показано, что мРНК, кодирующие белки, участвующие в процессах развития, например, факторы роста, транскрипционные факторы или продукты протоонкогенов (белки, для которых необходим чёткий контроль экспрессии), имеют 5'-НТО длиннее среднего[19], содержащие внутри инициаторные кодоны (англ. upstream initiation codons) и открытые рамки считывания, а также стабильные элементы вторичной структуры, препятствующие процессу трансляции (например, квадруплексы). Другие специфические мотивы и элементы вторичной структуры 5'-НТО могут модулировать эффективность трансляции[3].

В норме после перемещения мРНК из ядра в цитоплазму в области кэпа, расположенном на 5'-конце мРНК, собирается белковый комплекс eIF4F. В этот комплекс входят 3 субъединицы: eIF4Е (кэп-связывающий белок); eIF4А, обладающий хеликазной активностью; eIF4G, взаимодействующий с различными другими белками, в том числе с полиаденилат-связывающим белком. АТФ-зависимая хеликазная активность eIF4А, стимулируемая РНК-связывающим белком eIF4B, обеспечивает расплетание любых элементов вторичной структуры мРНК, в результате чего образуется «площадка для посадки» малой (40S) субъединицы рибосомы[20]. Если трансляцию сдерживает количество рибосом или концентрация факторов трансляции, 3'-поли(А)-хвост может взаимодействовать с 5'-кэпом, усиливая инициацию трансляции путём внедрения полиаденилат-связывающего белка, который может взаимодействовать с комплексом eIF4F[21].

Считается, что в эукариотических мРНК трансляция начинается с первого кодона AUG (стартовый кодон), который встретится рибосоме на её пути от 5'- к 3'-концу. Последовательности, окружающие стартовые кодоны, неслучайны и составляют консенсусную последовательность Козак. У млекопитающих эта последовательность имеет следующий вид: GCCRCCaugG, и наиболее консервативными нуклеотидами являются R (пурин, обычно А) на позиции −3 относительно AUG и G в позиции +4 относительно AUG. Строгое расположение А в позиции −3 и G в позиции +4 также характерно для других животных, растений и грибов. Последовательности, составляющие окружение AUG (частично они заходят в нетранслируемую область), могут модулировать эффективность трансляции, обеспечивая подходящее окружение для инициации[3].

Следует отметить, что от 15 % до 50 % 5'-НТО содержат внутри стартовый кодон AUG. Поэтому правило, согласно которому рибосома начинает трансляцию с первого стартового кодона, который встретится ей при перемещении от 5'- к 3'-концу мРНК, выполняется далеко не всегда. Это означает, что иногда рибосома может пропускать встречающиеся ей триплеты AUG и начинать трансляцию с более удалённого стартового кодона, возможно из-за того, что эти триплеты имеют «слабое» нуклеотидное окружение. Таким образом, с одной мРНК может быть синтезировано несколько различных белков[22]. Более того, установлено, что наличие внутренних кодонов AUG в 5'-НТО коррелирует с увеличенной длиной этой области и более «слабым» окружением обычно используемого стартового кодона, а в транскриптах с оптимальным окружением стартового AUG 5'-нетранслируемая область короткая и не содержит AUG[23]. В связи с этим AUG в 5'-НТО могут уменьшать уровень трансляции своей мРНК.

Если в 5'-НТО после внутреннего AUG, но перед основным стартовым кодоном располагается внутренний стоп-кодон, то образуется короткая открытая рамка считывания (англ. upstream open reading frame, uORF). После трансляции uORF и диссоциации от мРНК большой (60S) субъединицы рибосомы, судьба малой субъединицы может быть различной, и это может оказать влияние на эффективность трансляции и стабильность мРНК. Малая субъединица может остаться на мРНК, возобновить считывание и начать трансляцию с нижележащего кодона AUG, а может покинуть мРНК и тем самым понизить уровень трансляции основной открытой рамки считывания. У эукариот способность рибосомы к возобновлению трансляции ограничивается, во-первых, стоп-кодонами[24] и, во-вторых, длиной uORF: если длина uORF превышает 30 кодонов[25], рибосома не сможет возобновить трансляцию. Таким способом блокируется трансляция мРНК, содержащих uORF, кодирующих транскрипционные факторы дрожжей GCN₄ и YAP₁[26].

Важное значение в регуляции трансляции имеет вторичная структура 5'-НТО. Экспериментальные данные показывают, что умеренно стабильные элементы вторичной структуры (значение изменения свободной энергии ΔG выше −30 ккал/моль), непосредственно содержащие стартовый кодон AUG, не останавливают малую субъединицу рибосомы. Существенное влияние на эффективность трансляции оказывают очень стабильные структуры (ΔG ниже −50 ккал/моль), снижая её. Преодолению влияния таких структур способствует повышение концентрации eIF4A[27].

Строение элемента IRES вируса гепатита C

Существует альтернативный механизм инициации трансляции, не связанный с 5'-кэпом. Впервые он был описан у пикорнавирусов[28]. В этом случае внутри 5'-НТО существует особая последовательность, служащая для связывания рибосомы — IRES. В дальнейшем IRES были обнаружены во многих клеточных мРНК, кодирующих регуляторные белки, например, продукты протоонкогена c-Myc, гомеодоменные белки, факторы роста (например, фактор роста фибробластов FGF2), а также рецепторы к ним[3]. Сравнительный анализ известных клеточных IRES позволил выделить общий структурный мотив, характерный для содержащих их мРНК. В частности, для мРНК белка, связывающегося с тяжёлой цепью иммуноглобулина (BiP), и мРНК белка FGF-2 была описана Y-образная шпилька, расположенная непосредственно перед стартовым кодоном AUG[29]. Установлено, что короткие структурные мотивы, комплементарные малым рибосомным РНК, могут также выступать как IRES[30].

Последовательности, являющиеся мишенями транс-функционирующих РНК-связывающих белков, могут также принимать участие в регуляции трансляции. Например, железозависимый элемент IRE (англ. iron-responsive element), локализованный в 5'-НТО мРНК, кодирующих белки, вовлечённые в метаболизм железа (ферритин, 5-аминолевулинатсинтаза и аконитаза), может блокировать трансляцию. При этом происходит железозависимое связывание белков метаболизма железа, подавляющее нормальное сканирование мРНК, осуществляемое малой субъединицей рибосомы при инициации трансляции. Наконец, в большей части мРНК позвоночных, кодирующих рибосомные белки и факторы элонгации трансляции, содержится 5'-терминальный пиримидиновый тракт (англ. terminal oligopyrimidine tract (TOP)), непосредственно прилегающий к кэпу. Этот тракт необходим для координированной репрессии трансляции в ходе задержки роста, дифференциации, развития, а также активируется при употреблении некоторых препаратов[31].

Судьба мРНК является другой ключевой точкой в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, так как в отсутствие разрушения определённых мРНК их число будет расти, а значит, увеличится количество кодируемого ими белка, что может повлиять на экспрессию тех или иных генов. Было предложено несколько возможных механизмов разрушения мРНК: её деградация может запускаться укорочением или отрывом 3'-поли(А)-хвоста или 5'-кэпа[32]. Судьба мРНК в основном регулируется цис-регуляторными элементами, расположенными в 3'-НТО, например, AU-богатыми элементами (AREs), которые запускают распад мРНК под влиянием различных внутри- и внеклеточных сигналов. По имеющимся экспериментальным данным AREs разделили на 3 класса: для членов I и II класса характерно наличие множества копий пентануклеотида AUUUA, чего нет у представителей III класса[33]. AREs I класса контролируют цитоплазматическое деаденилирование путём деградации всего поли(А)-хвоста с одинаковой скоростью у всех транскриптов с образованием сначала промежуточных соединений с поли(А)-хвостом в 30—60 нуклеотидов, которые потом полностью деградируют. Такие элементы обнаруживаются в основном в мРНК, кодирующих ядерные факторы транскрипции, например, c-Fos и c-Myc (продукты генов «быстрого ответа»), а также мРНК, кодирующих некоторые цитокины, например, интерлейкины 4 и 6. Структурной характеристикой AREs I класса является наличие одной или нескольких копий пентануклеотида AUUUA после U-богатого участка. AREs II класса управляют асинхронным цитоплазматическим деаденилированием (то есть поли(А)-хвост различных транскриптов разрушается с различной скоростью), в результате которого образуется мРНК без поли(А)-хвоста. В число мРНК, содержащих такие элементы, входят мРНК цитокинов GM-CSF, интерлейкин 2, фактор некроза опухоли α (TNF-α), интерферон-α. Структурной особенностью AREs второго класса является наличие тандемных повторов пентануклеотида AUUUA, а AU-богатый участок располагается до этих повторов. У AREs III класса отсутствует пентануклеотид AUUUA и есть только U-богатый участок. Такой элемент есть, например, у мРНК, кодирующей c-Jun. Кинетика деградации мРНК в этом случае схожа с таковой у AREs I[3].

Деградация мРНК может также осуществляться за счёт эндонуклеазной активности, причём такой механизм зависим и от деаденилирования, и декэпирования. Этот механизм был обнаружен у мРНК, кодирующих трансферриновый рецептор. Деградация этих мРНК включает эндонуклеазное разрезание 3'-НТО, причём промежуточным этапом является распознавание IRE, а регуляция определяется уровнем внутриклеточного железа[34].

Путь NMD

Инициаторные кодоны в 5'-НТО и uORF также могут играть роль в особом механизме распада бессмысленных (англ. nonsense) («бракованных») мРНК — NMD (англ. nonsense-mediated mRNA decay). Сигналом, запускающим этот путь, является бессмысленный кодон, вслед за которым идёт соединение между двумя экзонами, образовавшееся при сплайсинге — комплекс сращивания экзонов, или EJC (англ. Exon junction complex)[35] (наличие такого соединения отличает преждевременный терминаторный кодон от основного, так как стоп-кодон и 3'-НТО располагаются после последнего экзона). Соединения экзонов распознаются благодаря маркерным белкам, присоединяющимся к непроцессированному транскрипту ещё в ядре и остающимся связанными с ним после процессинга и перехода мРНК в цитоплазму[36]. В случае мРНК дикого типа (то есть «небракованных») аппарат трансляции убирает маркерный белок для предотвращения деградации транскрипта. Если же рибосома встречает преждевременный стоп-кодон или если в транскрипте присутствуют uORF, она распадается, и меченная маркерными белками дефектная мРНК вовлекается в NMD[37]. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae (у них имеется второй сигнал, запускающий NMD — нижестоящие экзонные элементы (англ. downstream exonic element (DSE)) мРНК, содержащие функционально активные uORF, например, кодирующие GCN₄ и YAP₁, не деградируют по пути NMD. Дело в том, что между uORF и кодирующей последовательностью располагаются мРНК-специфические стабилизирующие последовательности, предотвращающие активацию NMD за счёт взаимодействия с РНК-связывающей убиквитин-лигазой Pub1[38].

uORF могут регулировать стабильность мРНК и независимо от NMD. В 5'-НТО мРНК гена YAP2 S. cerevisiae содержится 2 uORF, которые подавляют сканирование транскрипта рибосомой и способствуют распаду мРНК[26]. Дестабилизирующий эффект зависит от окружения терминаторного кодона, которое регулирует эффективность трансляции и стабильность мРНК.

Несколько исследований дают основание предположить, что многие гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (англ. heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs)) функционируют не только в ядре, но также контролируют судьбу мРНК в цитоплазме[39], регулируют трансляцию, стабильность мРНК и её локализацию в цитоплазме[37]. Примером может служить белок-предшественник амилоидов (англ. amyloid precursor protein (APP)). Повышение содержания APP является важным фактором развития болезни Альцгеймера. Стабильность мРНК APP зависит от высококонсервативного 29-нуклеотидного элемента, расположенного в 3'-НТО и взаимодействующего с различными РНК-связывающими цитоплазматическими белками[40].

Контроль экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, осуществляемый нетранслируемыми областями, особенно важен в период развития. Асимметричное расположение в клетке некоторых мРНК приводит к асимметричному расположению кодируемых ими белков. Это — наиболее удобный механизм локализации белков, так как одна мРНК может служить матрицей для нескольких кругов трансляции. Во многих случаях мРНК располагаются в рибонуклеопротеиновых комплексах вместе с белками трансляционного аппарата, тем самым гарантируя необходимую эффективность трансляции[3].

Существуют 3 основных механизма асимметричного расположения мРНК:

• активный направленный транспорт, в котором задействован функциональный цитоскелет и моторные белки, взаимодействующие с мРНК;
• локальная стабилизация транскриптов;
• диффузия мРНК, определяемая её локальным окружением[3].

мРНК основного белка миелина (англ. Myelin basic protein (MBP)) доставляется в отростки олигодендроцитов, образующих миелиновую обкладку аксонов ЦНС, через активный направленный транспорт. У мыши для транспорта и локализации мРНК служат особые сигнальные последовательности, располагающиеся в 3'-НТО: РНК-транспортный сигнал (длиной 21 нуклеотид), а также дополнительный элемент — регион РНК-локализации[41].

Многие примеры локальной стабилизации транскриптов обнаружены в ранних стадиях развития дрозофилы. Так, транскрипты, кодирующие РНК-связывающий белок Nanos и белок теплового шока Hsp83 деградируются везде, кроме цитоплазмы на заднем полюсе эмбриона. Различные цис-регуляторные элементы, располагающиеся в 3'-НТО соответствующих мРНК, отвечают как за деградацию этих мРНК по всему зародыщу, так и за их стабилизацию на заднем конце зародыша[42].

Явление диффузии мРНК, определяемой окружением, хорошо демонстрирует мРНК белка Bicoid у дрозофилы. Элементы, осуществляющие ключевой этап в этом процессе — заякоривание транскрипта, не полностью описаны, но один из участвующих в этом белок — Staufen — является дцРНК-связывающим белком, необходимым для остановки Bicoid на переднем конце зародыша[43].

Во всех приведённых выше примерах локализация регулировалась цис-регуляторными элементами, расположенными в 3'-НТО, но известны и такие элементы, расположенные в 5'-НТО и даже кодирующей области. Такие элементы известны как мРНК-архивирующие коды (англ. mRNA zip codes), они взаимодействуют с соответствующими связывающими белками (англ. zip-code-binding proteins), например, уже упоминавшимся Staufen. У архивирующих кодов отсутствует какое-либо сходство в первичной и вторичной структуре. Они могут иметь сложную (комплексную) вторичную и третичную структуру, в которой первичная структура (последовательность нуклеотидов) не так важна, как пространственная структура[44], а могут, напротив, быть короткими нуклеотидными последовательностями[45], иногда входящими в повторяющиеся элементы (например, в случае транскрипта Vg1 у лягушки Xenopus[46]).

Альтернативный сплайсинг является важнейшим путём образования из одного исходного транскрипта различных мРНК, кодирующих одинаковые или различные белки. При этом, помимо длинных белоккодирующих мРНК, могут образовываться и некодирующие РНК. Разрезанная мРНК может подвергнуться процессу рекэпирования с образованием мРНК с укороченной 5'-нетранслируемой областью или же кодирующая лишь фрагмент исходного белка. Кроме того, известно, что образовавшиеся в ходе альтернативного сплайсинга 3'-НТО-фрагменты могут начать функционировать как транс-регуляторные некодирующие РНК независимо от основной РНК[47].

Циркуляризация (замыкание в петлю) мРНК

Известно, что мРНК способна замыкаться в петлю (циркуляризация) за счёт взаимодействия специфических белков, связывающихся с поли(А)-хвостом, способствующих связыванию фактора eIF4F с кэпом. В результате мРНК приобретает замкнутую форму, стимулируется инициация трансляции и повышается эффективность трансляции. Однако в некоторых случаях 5'-НТО и 3'-НТО одной и той же мРНК могут связываться друг с другом комплементарно. Так, у мРНК человеческого гена, кодирующего транскрипционный фактор p53, имеются участки в 5'-НТО и 3'-НТО, комплементарные друг другу. Связываясь друг с другом и с трансляционным фактором RPL26, они тем самым способствуют повышению эффективности трансляции, что является одной из причин быстрого накопления белка р53 в ответ на повреждения ДНК[48].

Анализ мРНК различных генов человека показал, что в 5'-НТО присутствует мотив, специфически взаимодействующий с 3'-концами микроРНК, при этом во многих таких мРНК на 5'-конце имеется сайт, комплементарный 3'-НТО. Дальнейшие исследования показали, что связывание 5'-НТО с микроРНК облегчает связь 5'-конца мРНК с 3'-концом, и мРНК, активность которых значительно определяется микроРНК, имеют предсказуемые сайты связывания на обеих НТО. Такие мРНК получили название miBridge. Далее было установлено, что утрата этих сайтов связывания уменьшала репрессию трансляции транскрипта, управляемую микроРНК. Так было выяснено, что сайты связывания НТО друг с другом необходимы для подавления трансляции мРНК. Это свидетельствует о том, что комплементарное взаимодействие 5'-НТО и 3'-НТО необходимо для точной регуляции экспрессии генов[49].

3D-структура TPP-рибопереключателя[50]

В мРНК бактерий также имеются 5'- и 3'-нетранслируемые области[51][52]. Длина 5'-НТО бактерий значительно меньше таковой у эукариот и составляет обычно 3—10 нуклеотидов. Например, длина 5'-НТО транскрипта лактозного оперона Escherichia coli составляет лишь 7 нуклеотидов[53]. В 5'-НТО бактерий локализована последовательность Шайна — Дальгарно (AGGAGG)[54], служащая для связывания рибосомы и отделённая спейсером от стартового кодона AUG. Хотя 5'-НТО бактерий и эукариот различны, было показано, что добавление нуклеотидов СС в спейсер мРНК гена Ner бактериофага Mu, хорошо экспрессирующегося в клетках Escherichia coli и Streptomyces, привело к успешной экспрессии этого гена в клетках ретикулоцитов кролика[55].

Элементы вторичной структуры, локализованные в 5'-НТО, как правило, оказывают подавляющее действие на трансляцию[56]. В частности, именно в 5'-НТО обычно располагаются аттенюаторы — элементы оперонов, вызывающие преждевременную терминацию трансляции[57] (наиболее известным примером аттенюации является экспрессия триптофанового оперона).

Кроме того, в 5'-НТО бактерий располагается большая часть рибопереключателей[58] — регуляторных элементов мРНК, способных связываться с малыми молекулами, что приводит к изменению эффективности образования белка, кодируемого этой мРНК[59].

В отличие от эукариот, длинные 3'-НТО редки у бактерий и слабо изучены. Тем не менее, известно, что у некоторых бактерий, в частности, Salmonella enterica, имеются мРНК с длинными 3'-НТО, похожими на эукариотические (у S. enterica это мРНК hilD). Предполагается, что 3'-НТО hilD выполняют различные функции, в частности, влияют на обращение своих мРНК, поскольку делеция этих областей вызывала увеличение количества соответствующих мРНК[60].

Нетранслируемые области имеются и в мРНК многих архей. В частности, в 5'- и 3'-НТО мРНК метаногенной археи Methanocaldococcus jannaschii (как и у других представителей порядков Methanopyrales и Methanococcales) локализован элемент SECIS, ответственный за вставку аминокислоты селеноцистеина в полипептидную цепь[61].

Установлено, что мРНК большинства галоархей, а также Pyrobaculum и Sulfolobus лишены выраженной 5'-НТО, но у мРНК архей-метаногенов имеются длинные 5'-НТО. В связи с этим предполагается, что механизм инициации трансляции метаногенных архей может быть отличен от такового у остальных представителей этого домена[56]. Тем не менее, в мРНК галоархей имеются 3'-НТО и их 3'-концы не подвергаются посттранскрипционной модификации. Удивительным является тот факт, что в тех транскриптах галоархей, у которых есть 5'-НТО, отсутствует последовательность Шайна — Дальгарно. Длина же 3'-НТО галоархей составляла от 20 до 80 нуклеотидов; никаких консервативных структурных мотивов и последовательностей, кроме пента-U-нуклеотида в области терминации трансляции, выявлено не было[62].

Для мРНК архей описаны рибопререключатели, в том числе TPP-рибопереключатели (связываются с тиаминпирофосфатом (TPP)), которые располагаются в 5'-НТО (подобные рибопереключатели имеются также у бактерий и эукариот)[63].

РНК-геном полиовируса. В 5'-НТО находится IRES.

У многих вирусов инициация трансляции происходит по кэп-независимому механизму и осуществляется через уже упоминавшиеся элементы IRES, локализованные в 5'-НТО[64]. Например, так происходит у ВИЧ, вирусов гепатита A и С[65]. Такой механизм инициации трансляции удобен тем, что в его случае нет необходимости в сборке пре-инициаторного белкового комплекса, и вирус может быстро размножаться[53].

У вирусов существует и другой кэп-независимый механизм инициации трансляции, не связанный с IRES. Такой механизм имеется у многих вирусов растений. В этом случае имеется особый кэп-независимый трансляционный элемент (англ. cap-independent translation element (CITE)), расположенный в 3'-НТО. Нередко CITE связывает факторы трансляции, например, комплекс eIF4F, и затем комплементарно взаимодействует с 5'-концом, доставляя факторы инициации трансляции к месту её начала[66].

У вирусов, геном которых представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности, 3'-НТО не только оказывает влияние на трансляцию, но также задействована в репликации: именно с неё начинается репликация вирусного генома[67].

Вирус кори (род Morbillivirus семейства Paramyxoviridae) имеет геном, представленный одноцепочечной молекулой РНК отрицательной полярности. Для его генов М и F был установлен интересный механизм. мРНК этих генов имеют длинные НТО, на их долю приходится ~6,4 % всей мРНК. Хотя эти гены непосредственно не участвуют в репликации, 3'-НТО мРНК гена М увеличивает скорость накопления белка М и тем самым запускает репликацию генома. В то же время 5'-НТО мРНК гена F снижает образование белка F и тем самым подавляет репликацию[68].