Азотобактер

Клетки бактерий рода Azotobacter относительно крупные (1—2 мкм в диаметре), обычно овальные, но обладают плеоморфизмом, то есть могут иметь разную форму — от палочковидной до сферической. На микроскопических препаратах клетки могут располагаться одиночно, парами, неправильными скоплениями или, изредка, цепочками различной длины. Формируют особые покоящиеся формы — цисты, не образуют спор.

В свежих культурах клетки подвижны за счёт многочисленных жгутиков[6]. В более поздних культурах клетки теряют подвижность, приобретают почти кокковидную форму и продуцируют толстый слой слизи, формирующий капсулу клетки. На форму клетки также оказывает влияние химический состав питательной среды — пептон, например, вызывает плеоморфизм и, в том числе, индуцирует образование так называемых «грибоподобных» клеток. Индуцирующее влияние на плеоморфизм в культурах представителей рода Азотобактер в составе пептона оказывает аминокислота глицин[7].

При микроскопии в клетках наблюдаются включения, часть из которых окрашивается, а часть остаётся бесцветными. В начале XX века считалось, что прокрашиваемые включения являются «репродуктивными гранулами», или гонидиями, и принимают участие в размножении клетки, являясь своеобразными «зародышевыми» клетками[8], однако затем было доказано, что гранулы не принимают участия в размножении клеток и не являются «малыми, коккоподобными репродуктивными клетками» бактерий — гонидиями[9]. Прокрашиваемые гранулы состоят из волютина, неокрашивающиеся же гранулы являются каплями жира. Гранулы являются резервным источником питания.[10]

Циста представителей рода Azotobacter: видно центральное тело с вакуолями и многослойная оболочка

Цисты представителей рода Azotobacter более устойчивы к действию неблагоприятных факторов внешней среды, чем вегетативные клетки — так, цисты в два раза более устойчивы к действию ультрафиолетового излучения чем вегетативные клетки, устойчивы к высушиванию, гамма-излучению, солнечной иррадиации, действию ультразвука, однако не являются устойчивыми к действию высоких температур.[11]

Формирование цист индуцируется изменением концентрации питательных веществ в питательной среде и добавлением некоторых органических веществ (например, этанола, н-бутанола и β-гидроксибутирата). Цисты редко образуются в жидких питательных средах[12]. Инцистирование может быть индуцированно химическими факторами и сопровождается метаболическими сдвигами, изменениями в катаболизме и дыхании, изменениями в биосинтезе макромолекул[13]. Определённое значение в индукции инцистирования имеет альдегиддегидрогеназа[14], а также регулятор ответа AlgR[15].

Циста азотобактера — сферическое тело, состоящее из так называемого центрального тела (уменьшенной копии вегетативной клетки с большим количеством вакуолей) и двуслойной оболочки, внутренняя часть которой называется интима и имеет волокнистое строение[16], а внешняя называется экзина и представлена ровной, отражающей структурой, имеющей гексагональное кристаллическое строение[17]. Экзина частично гидролизуется трипсином и устойчива к действию лизоцима, в отличие от центрального тела[18]. Центральное тело может быть изолировано в жизнеспособном состоянии некоторыми хелатирующими агентами[19]. Главными компонентами внешней оболочки цисты являются алкилрезорцинолы, состоящие из длинных алифатических цепей и ароматических колец. Алкилрезорцинолы встречаются также у других бактерий, животных и растений[20].

Циста представителей рода Azotobacter является покоящейся формой вегетативной клетки, необходимой для переживания неблагоприятных факторов внешней среды, и не служит для размножения. После возобновления оптимальных условий, таких, как оптимальное значение pH, температуры и поступления доступного источника углерода, цисты прорастают, образовавшаяся вегетативная клетка вновь размножается путём простого деления клетки. При прорастании цист экзина цисты повреждается, и высвобождается большая вегетативная клетка.

Микроскопически первым проявлением прорастания спор является постепенное понижение преломления света цистами при фазово-контрастной микроскопии. Прорастание цист — медленный процесс и длится около 4—6 часов, на протяжении которых центральное тело увеличивается и происходит захват гранул волютина, прежде находившихся в интиме. Затем экзина лопается и вегетативная клетка высвобождается из экзины, имеющей характерную подковообразную форму[21]. При прорастании цисты отмечаются метаболические изменения. Сразу после прибавления источника углерода к среде цисты начинают поглощать кислород и выделять двуокись углерода, скорость дыхания повышается до максимальных значений через 4 часа после прибавления глюкозы. Синтез белков и РНК также начинается после прибавления источника углерода к среде, однако интенсификация синтеза макромолекул отмечается лишь через 5 часов после прибавления источника углерода. Синтез ДНК и фиксация азота инициируются через 5 часов после прибавления глюкозы к безазотистой питательной среде[22].

Во время прорастания цист отмечаются изменения в интиме, видимые на электронно-микроскопических препаратах. Интима состоит из углеводов, липидов и белков и занимает почти такой же объём в клетке, что и центральное тело. Во время прорастания цист интима гидролизируется и используется клеткой для синтеза компонентов клетки[23].

Получают энергию в ходе окислительно-восстановительных реакций, используя в качестве донора электронов органические соединения. Для роста необходим кислород, но способны расти при пониженных концентрациях кислорода, образуют каталазу и оксидазу. Способны использовать различные углеводы, спирты и соли органических кислот в качестве источников углерода. Азотфиксаторы способны фиксировать по крайней мере 10 мкг азота на грамм потреблённой глюкозы, фиксация азота зависит от наличия ионов молибдена, отсутствие молибдена может быть частично замещено ионами ванадия. В качестве источников азота могут использовать нитраты, ионы аммония и аминокислоты. Оптимум pH для роста и фиксации азота 7,0—7,5, способны расти в диапазоне pH от 4,8 до 8,5.[24] Возможен также зависимый от водорода миксотрофный рост представителей рода Azotobacter на безазотистой питательной среде, содержащей маннозу. Водород доступен в почве, поэтому не исключена возможность миксотрофии у представителей рода Azotobacter в природных условиях.[25]

Представители рода Azotobacter способны использовать углеводы (например маннит, сахарозу, глюкозу), спирты (в том числе этанол и бутанол) и соли органических кислот, в том числе и бензоаты, в качестве источника углерода и энергии. Представители рода растут на безазотистых средах, предназначенных для выделения свободноживущих азотфиксирующих и олигонитрофильных организмов, например на среде Эшби, содержащей источник углерода (маннит, сахароза или глюкоза) и необходимые микроэлементы (источник фосфора, серы и т. д.), или на среде М. В. Фёдорова, содержащей больше микроэлементов[26], а также на жидкой среде Бейеринка.

На плотных питательных средах представители рода образуют плоские, слизистые колонии пастообразной консистенции диаметром 5—10 мм, в жидких питательных средах образуют плёнки. Характерно также пигментирование, колонии представителей рода могут быть окрашены в тёмно-коричневый, зелёный и других цветов, или же могут быть бесцветными в зависимости от видовой принадлежности. Представители рода Azotobacter являются мезофильными микроорганизмами и растут при температуре 20—30 °C.[27]

Представители рода Azotobacter продуцируют пигменты. Например, типовой вид рода Azotobacter chroococcum продуцирует тёмно-коричневый водорастворимый пигмент (в видовом эпитете как раз отражена эта способность) меланин. Продукция меланина у Azotobacter chroococcum наблюдается при высоких уровнях дыхания во время фиксации азота и, предположительно, также защищает нитрогеназную систему от действия кислорода при аэроадаптации[28] Другие виды рода Azotobacter также продуцируют пигменты от жёлто-зелёного до пурпурного цвета.[29] Также представители рода способны продуцировать зеленоватый флюоресцирующий пигмент, флюоресцирующий жёлто-зелёным светом и пигмент, флюоресцирующий бело-голубым светом.[30]

Частично завершено определение нуклеотидной последовательности хромосомы Azotobacter vinelandii штамма AvOP. Хромосома Azotobacter vinelandii — кольцевая молекула ДНК размером 5 342 073 пар нуклеотидов и содержит 5043 генов, из которых 4988 кодируют белки, доля Г+Ц пар составляет 65 %.[31] Отмечено изменение плоидности представителей рода Azotobacter на протяжении жизненного цикла: по мере старения культур количество хромосом в клетках и содержание ДНК увеличивается — в стационарной фазе роста культуры могут содержать более 100 копий хромосомы на клетку. При пересеве на свежую питательную среду первоначальное содержание ДНК (одна копия) восстанавливается[32] Кроме хромосомальной ДНК, у представителей рода Azotobacter обнаружены плазмиды[33], доказана и возможность трансформации представителей рода Azotobacter экзогенной плазмидной ДНК[34].

Нитрогеназный комплекс является важнейшим ферментом, участвующим в азотфиксации. У представителей рода Azotobacter обнаружено несколько типов нитрогеназ — Mo-Fe-нитрогеназа[48] и альтернативные нитрогеназы: Ванадий-содержащая, не зависимая от ионов молибдена[49][50][51], более активная чем Mo-Fe-нитрогеназа в условиях пониженных температур — так, эффективная фиксация азота не прекращалась V-нитрогеназой вплоть до понижения температуры до 5 °C, активность V-нитрогеназы понижалась при понижении температуры в 10 раз меньше, чем у Mo-Fe-нитрогеназы[52], и Fe-содержащая, менее активная, чем обычная нитрогеназа[53][54]. Важную роль в образовании активной нитрогеназы играет созревание Р-кластера Mo-Fe-нитрогеназы[55], также как и предшественник Mo-Fe-кофактора нитрогеназы[56], шаперон GroEL, играет важную роль в завершающей перестройке нитрогеназы[57]. Регуляция активности нитрогеназы может осуществляться образованием осадка аргинина[58] Синтез нитрогеназы осуществляется под контролем т. н. nif-генов.[59] Фиксация азота регулируется nifLA опероном, продукт NifA регулирует транскрипцию nif-генов, NifL имеет антагонистичное действие по отношению к действию NifA в ответ на поглощённый азот и в зависимости от уровня поступления кислорода в клетку, экспрессия nifLA оперона регулируется по механизму позитивной регуляции.[60] NifL является флавопротеином, модулирующим активацию транскрипции генов азотфиксации путём редокс-зависимого переключения.[61] Двухкомпонентная система регуляции, состоящая из двух белков (энхансера NifA и сенсора NifL), образующих комплексы между собой, является атипичной и не распространённой среди других организмов системой регуляции экспрессии генов.[62]