Гигантские вирусы

История изучения гигантских вирусов началась в 1992 году в Англии. Изучая причины возникновения вспышки пневмонии, учёные исследовали образцы воды, взятые из воздухоохлаждающей системы. Образцы некоторое время инкубировали вместе с культурой амёб Acanthamoeba polyphaga, чтобы выявить внутриклеточные патогенные микроорганизмы, похожие на бактерий рода Legionella, которые обитают внутри амёб. Исследователи смогли обнаружить неизвестный патоген, который был видим в световой микроскоп и красился по Граму положительно, в связи с чем и был отнесен к бактериям. Однако новооткрытую бактерию никак не удавалось вырастить в чистой культуре без амёб. В течение более чем десяти лет попытки классифицировать новую бактерию не давали результатов. Стандартный способ определения новых видов бактерий и архей основан на размножении с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) участка генома, кодирующего 16S рРНК, и его последующем секвенировании. Однако получить этот участок генома неизвестной бактерии никак не удавалось, несмотря на использование разнообразных протоколов ПЦР. В 2003 году неизвестный микроорганизм изучила с помощью электронной микроскопии французская исследовательская группа Дидье Рауля. Оказалось, что это не бактерия, а очень крупный вирус с икосаэдрическим капсидом. За свое сходство с микроорганизмами новый вирус получил название «мимивирус» (от англ. mimicking microbes — «похожий на микроорганизмы»). С самого открытия вирусов в конце XIX века было принято считать, что вирусы невозможно рассмотреть с помощью светового микроскопа, поэтому открытие мимивируса противоречило устоявшимся догмам вирусологии. Генов 16S рРНК у мимивируса не было просто потому, что у вирусов не бывает рибосом[3].

После открытия мимивируса множество исследовательских групп начали инкубировать культуры амёб с различными образцами из окружающей среды, и по прошествии некоторого времени во многих случаях в культуре обнаруживали очень крупные вирусы. Появилось множество усовершенствований первоначального протокола, делающих его всё более и более эффективным. Впоследствии учёные стали выращивать вирусы не только в культурах амёб, но и в культурах других протистов. Одних видов мимивирусов на данный момент известно около сотни. Гигантские вирусы были обнаружены даже в образце сибирской вечной мерзлоты. В последние годы несколько гигантских вирусов удалось обнаружить с помощью метагеномики. В 2008 году был открыт первый вирофаг (Спутник) — вирус, который может размножаться в клетках только в присутствии вируса-хозяина (как правило, гигантского вируса) и мешает его успешному размножению. На данный момент известно более десяти видов вирофагов[3].

Под гигантскими вирусами обычно понимают вирусы с геномом длиннее 200 тысяч пар оснований (п. о.) и вирионами больше 0,2 мкм в диаметре. Кроме того, гигантским вирусам присущ ряд общих генетических и структурных особенностей. Во-первых, их геномы всегда представлены двухцепочечной ДНК и содержат значительную долю генов-сирот — от 31 % у Cedratvirus до 84 % у Pandoravirus salinus. Генами-сиротами называют гены, которые больше не обнаруживаются ни у каких живых организмов (в англоязычных источниках их называют ORFans из-за игры слов: ORF (open reading frame) — открытая рамка считывания, а слово ORFan звучит как orphan — «сирота»). Во-вторых, в их геномах имеются интроны и интеины (участки белковых молекул, которые могут сами вырезаться и сращивать концы разрыва), а также мобильные генетические элементы (трансповироны у мимивирусов и MITEs у Pandoravirus salinus)[4].

Самым главным отличием гигантских вирусов от остальных вирусов является то, что в их геномах закодированы молекулы, принимающие участие в трансляции: аминоацил-тРНК-синтетазы, факторы трансляции и тРНК. Таких генов нет только у Pithovirus sibericum. Представители родов Marseillevirus, Pithovirus, Faustovirus, Kauamoebovirus и Cedratvirus не имеют генов, кодирующих тРНК. Гигантских вирусов сближают и некоторые особенности структуры. Например, вирионы мимивируса и Marseillevirus снабжены особыми фибриллами. Для выхода генетического материала в цитоплазму амёбы у гигантских вирусов имеются поры, находящиеся в вершинах капсидов или тегументов. У тех гигантских вирусов, вирионы которых покрыты настоящим капсидом, в его мажорном белке имеется особый мотив, известный как двойной jelly-roll fold. Он имеется только у белков капсидов вирусов с двухцепочечным геномом и нигде более в живом мире. Такие белки формируют олигомеры по типу черепицы, в конечном итоге собираясь в замкнутую белковую оболочку[5]. У Faustovirus с двуслойным капсидом мотив jelly-roll обнаруживается только у белков верхнего слоя[4].

Таксономическое положение гигантских вирусов ещё не до конца определено, и многие недавно описанные виды, роды и даже семейства гигантских вирусов ещё не получили официального признания Международным комитетом по таксономии вирусов (англ. International committee on virus taxonomy, ICTV). Пока ICTV признал два семейства гигантских вирусов: Mimiviridae и Marseilleviridae. В 2012 году было предложено^[кем?] объединить гигантских вирусов и NCLDV в новый порядок — Megavirales. В порядок Megavirales хотят включить Mimiviridae, Marseilleviridae, Ascoviridae, Iridoviridae, Phycodnaviridae, асфаровирусы и поксвирусы[4].

Большинство известных на данный момент гигантских вирусов поражает амёбы рода Acanthamoeba. Однако неизвестно, есть ли у них другие хозяева. Эти амёбы питаются самыми разнообразными микроорганизмами: бактериями, дрожжами и другими грибами, вирусами и водорослями, поэтому в их цитоплазме находится много чужеродной ДНК. Вероятно, мозаицизм геномов гигантских вирусов обусловлен интенсивным горизонтальным переносом генов от «соседей по клетке». Некоторые гигантские вирусы описаны у другого вида амёб — V. vermiformis. Ряд далёких родственников мимивирусов заражает морских жгутиконосцев и одноклеточные водоросли. Попытки использовать для выращивания гигантских вирусов клетки, отличные от амёб, пока не увенчались успехом[4].

Однако имеются некоторые свидетельства, что гигантские вирусы могут обитать не только в амёбах. Например, эксперименты показали, что мимивирусы могут проникать в фагоцитирующие клетки (моноциты и макрофаги) человека и мыши, а у мышей даже описали мимивирусную инфекцию, затронувшую макрофаги. Показано также, что мимивирус может размножаться в одноядерных периферических кровяных клетках человека, стимулируя выделение интерферона I типа и подавляя экспрессию генов, стимулируемых интерфероном, в этих клетках. Кроме того, вирусы рода Marseillevirus могут проникать в иммортализованные человеческие Т-лимфоциты, и их даже удалось обнаружить в макрофагах из лимфоузлов[4].

Жизненный цикл гигантских вирусов длится от 6 до 24 часов. Как правило, вирусы оказываются в клетке посредством фагоцитоза, однако вирусы рода Marseillevirus могут попадать в цитоплазму при помощи эндоцитоза. Этим гигантские вирусы значительно отличаются от остальных вирусов, которые проникают в клетку после взаимодействия с рецепторами на её поверхности. После попадания вириона в цитоплазму его внутренняя мембрана, залегающая под капсидом, сливается с мембраной везикулы, и содержимое вириона изливается в цитоплазму. После этого начинается формирование вирусных фабрик — особых зон цитоплазмы, где проходят репликация вирусной ДНК и сборка вирусных частиц. Нередко при инфицировании гигантскими вирусами изменяется и морфология ядра. В клетках, заражённых Pandoravirus или Mollivirus, наблюдаются впячивания ядерной оболочки, а в случае Mollivirus вирусные фабрики даже попадают в ядро. По сути, вирусная фабрика становится функциональным ядром клетки, заражённой вирусом (вироклетки)[4].

Сборка вирионов у гигантских вирусов происходит по-разному. В случае мимивирусов образование внутренней мембраны, сборка капсида, упаковка ДНК и сборка фибрилл происходят последовательно и сопровождаются перемещением вирионов из центра вирусной фабрики к её краям. У Pandoravirus и Mollivirus сборка оболочки и внутреннего содержимого вириона происходят одновременно. Выход вирионов гигантских вирусов сопровождается лизисом клетки амёбы, и только вирионы Mollivirus покидают клетку посредством экзоцитоза[4].

Судя по наличию в геномах гигантских вирусов генов, кодирующих белки транскрипции и трансляции, в плане репликации они в той или иной мере независимы от клетки-хозяина. Впрочем, Pandoravirus, Mollivirus и один из Marseilleviridae лишены белков, связанных с транскрипцией, поэтому для их репликации всё-таки необходимо ядро амёбы. В случае одного представителя Marseilleviridae транскрипция начинается в вирусной фабрике, но, по-видимому, за счёт привлечения транскрипционного аппарата клетки-хозяина[4].

Вирион вирофага Спутник

Вместе с открытием нового члена семейства мимивирусов,^[дата?] Mamavirus, был открыт первый вирофаг — вирус, размножение которого зависит от вируса-хозяина. В вирусных фабриках мамавируса обнаружили маленькие икосаэдрические вирионы, не похожие на вирионы Mamavirus. Новый вирус получил название «вирофаг Спутник»[4].

Геномы вирофагов представлены кольцевой ДНК длиной от 17 до 29 тысяч п. о. и содержат 16—34 гена, из которых некоторые гомологичны генам гигантских вирусов. После Спутника описали ещё несколько вирофагов, размножающихся при участии мимивирусов всех трёх линий (А, В и С). Был описан вирофаг, который мог паразитировать только на мимивирусах линий В и С; мимивирусы линии А были к нему устойчивы. Этот вирофаг получил название Замилон. При этом в геноме мимивирусов линии А нашли последовательности, принадлежащие Замилону. Образуемый ими кластер получил название MIMIVIRE (от англ. mimivirus virophage resistant element), и вначале считалось, что принцип его работы схож с работой бактериальных систем CRISPR/Cas, обеспечивающих защиту от бактериофагов. Тем не менее последние исследования говорят о том, что MIMIVIRE не имеет к CRISPR/Cas никакого отношения. Любопытно, что копии геномов вирофагов обнаружены в геноме морской хлорарахниофитовой водоросли Bigelowiella natans[4].

Гигантские вирусы страдают не только от вирофагов. В 2012 году в геноме одного из мимивирусов были найдены мобильные генетические элементы, получившие название «трансповироны». Трансповироны состоят из семи тысяч п. о. и содержат 6—8 белоккодирующих генов, а на их концах находятся длинные инвертированные повторы. Все трансповироны кодируют белки, содержащие хеликазный домен I типа и домен с цинковыми пальцами типа Cys2His2 (C2H2). По-видимому, для размножения трансповироны используют как собственные белки, так и белки вируса-хозяина. Трансповироны выявляются даже в геномах вирофагов, вставленных в геном водоросли B. natans[9]. Как уже было упомянуто, мобильные генетические элементы (известные как MITEs) выявлены в геноме Pandoravirus salinus. Как и трансповироны, они имеют концевые инвертированные повторы, но не кодируют никаких белков[10].

Одной из самых необычных черт, отделяющих гигантские вирусы от прочих вирусов, является наличие генов, продукты которых задействованы в трансляции. У Tupanvirus имеется даже полный комплект белков и РНК, необходимых для трансляции, кроме компонентов рибосом. Французский микробиолог Дидье Рауль (впервые изучивший мимивирус) высказал предположение, что гигантские вирусы возникли как результат эволюционной редукции древней клетки и представляют собой четвёртый домен жизни, наряду с археями, бактериями и эукариотами. Возможно, что во время возникновения гигантских вирусов на Земле обитали несколько независимо возникших линий клеточных организмов, из которых до наших дней дожила одна, а гигантские вирусы могут быть потомками одной из вымерших линий[11].

Однако в строгом смысле слова гигантские вирусы не могут являться доменом, поскольку разделение клеточных организмов на три домена было осуществлено путём сравнения генов рРНК, которых у гигантских вирусов нет. Поэтому в 2013 году Дидье Рауль предложил отказаться от системы трёх доменов и перейти к системе четырёх TRUC — аббревиатура от Things Resisting Uncompleted Classification (с англ. — «сущности, не поддающиеся незавершённой классификации»). Таким образом всю земную жизнь можно подразделить на четыре TRUC — эукариоты, бактерии, археи и гигантские вирусы. При этом остальные вирусы по-прежнему остаются вне системы живого мира. Выделение гигантских вирусов в отдельную ветвь жизни скептически встретил американский биолог Евгений Кунин, который считает, что обособление гигантских вирусов связано с ошибками реконструкции филогении, а большое число генов, общих с клеточными организмами, есть результат горизонтального переноса[11].

Гигантские вирусы являются микроорганизмами, так как микроорганизмы, по определению, — это организмы, различимые в световой микроскоп, что в полной мере относится к гигантским вирусам[3].

Тот факт, что вирусная фабрика гигантских вирусов, по сути, является ядром заражённой клетки (вироклетки), наводит на мысль, что эволюция гигантских вирусов и эволюция эукариот могут быть тесно связаны. Сходство вирусной фабрики и клеточного ядра отнюдь не поверхностно: обе структуры залегают в цитоплазме, и часто вирусные фабрики окружают себя мембранами эндоплазматического ретикулума, которые служат источником мембран для вирионов. У многих NCLDVs вирусные фабрики собираются вблизи центра организации микротрубочек, который задействован в делении ядра. С помощью атомно-силовой микроскопии было показано, что вирусные фабрики также образуются при слиянии везикул, произошедших от впячивания ядерной оболочки. Наконец, Mollivirus и отчасти Pandoravirus используют в качестве вирусной фабрики само ядро, а в роли источника для внутренних мембран вирионов — ядерные мембраны[12].

Можно предположить, что клеточное ядро произошло от вирусной фабрики древнего NCLDV, размножавшегося в протоэукариотической клетке. После этого вирусный геном слился с геномом протоэукариотической клетки и утратил способность к формированию вирионов, навеки став частью эукариотического генома[12].

Предлагался и другой сценарий, согласно которому гигантские вирусы, наоборот, произошли от ядра древней эукариотической клетки. Можно предположить, что клеточное ядро стало вирусной фабрикой, после того как в нём появились гены, необходимые для формирования вирионов. Впрочем, неясно, каким образом в вирион могла упаковаться целая хромосома[12].

Согласно третьей гипотезе, клеточное ядро появилось в качестве защитной структуры в результате взаимодействия протоэукариотической клетки с вирусом. Ядро давало возможность обезопасить репликацию и транскрипцию генома клетки от действия вируса, однако в ходе эволюции большинство вирусов научилось преодолевать эту преграду[12].

Судя по всему, гигантские вирусы распространены в природе очень широко: их удалось обнаружить в пробах морской и пресной вод, а также в образцах почв, собранных по всему миру. Их амёбы-хозяева также распространены очень широко и часто обитают рядом с человеком. Некоторые гигантские вирусы, а именно мимивирусы, удалось выделить из различных животных — устриц, пиявок, мартышек и коров. Marseillevirus выделили из двукрылых насекомых, а фаустовирус однажды был найден в организме мокреца[13].

Гигантские вирусы неоднократно обнаруживали в биологических материалах, взятых от людей. Они были выявлены в кале и крови здоровых людей, соскобах верхних дыхательных путей больных пневмонией и даже в жидкости для контактных линз, использовавшихся пациентами с кератитом. В 2013 году Marseillevirus обнаружили в крови и лимфоузлах одиннадцатимесячного ребёнка, страдавшего от аденита. Гигантские вирусы часто выявляют в метагеномных данных, связанных с человеком. Так, последовательности, вероятно, принадлежащие мимивирусам, обнаружены в человеческом кале и копролитах, слюне, слизистой вагины. Последовательности, относящиеся к вирофагам, найдены в желудочно-кишечном тракте. Pandoravirus, Pithovirus и Faustovirus были выявлены в плазме крови пациентов, страдающих от разных патологий печени[13].

Мимивирусы могут проникать в человеческие и мышиные фагоциты. В течение 30 часов после попадания мимивируса в мышиный макрофаг количество вирусной ДНК в клетке значительно увеличивается, а экстракт из заражённых макрофагов приводит к лизису амёб. Также было обнаружено, что мимивирус может размножаться в одноядерных клетках периферической крови человека и подавлять в этих клетках экспрессию генов, стимулированных интерфероном. Через 21 день после заражения Marseillevirus иммортализованных человеческих Т-лимфоцитов в них удалось выявить не только вирусную ДНК, но и целые вирионы. Таким образом, гигантские вирусы могут успешно размножаться и вне амёб[13].

Мимивирус был обнаружен случайно при исследовании причин вспышки пневмонии. В плазме крови пациентов с пневмонией мимивирусы обнаруживают в существенно бóльшем количестве, чем у здоровых людей. У пациентов, заразившихся пневмонией уже в больнице, в крови выявляли многочисленные антитела против мимивируса. При этом независимые исследования показали, что в больницах мимивирусы присутствуют в гораздо бóльшем количестве, чем в обычных помещениях. Был описан один случай заболевшего пневмонией лаборанта, который много работал с мимивирусом голыми руками. В его крови обнаружили антитела к 23 белкам мимивируса, из которых 4 были уникальны для мимивируса. Похожий случай произошёл в 1968 году с лаборантом, не соблюдавшим правила техники безопасности при работе с вирусом Эпштейна — Барр, который в итоге заболел инфекционным мононуклеозом. Как стало известно впоследствии, инфекционный мононуклеоз вызывается именно вирусом Эпштейна — Барр. У двух пациентов, вернувшихся во Францию из поездки в Лаос и страдавших от астении, лихорадки, миалгии и тошноты, в крови выявили антитела к вирофагу Спутник, который паразитирует на мимивирусах[13].

Таким образом, на данный момент однозначно записать гигантские вирусы в список человеческих патогенов ещё рано, однако можно определённо сказать, что они участвуют в патогенезе многих заболеваний человека[13].

Комментарии

Источники

• Елизавета Минина. Гиганты вирусного мира. Статья на Биомолекула.ру (неопр.) (31 августа 2018). Дата обращения: 22 января 2019.