Эндоспоры

Эндоспоры образуют представители около 25 родов из типа фирмикут: Bacillus, Clostridium, Dendrosporobacter, Desulfosporosinus, Desulfotomaculum, Halobacillus, Heliophilum, Oscillospira, Sporobacter, Sporobacterium, Sporohalobacter, Sporolactobacillus, Sporomusa, Sporosarcina, Sporotomaculum, Sulfobacillus, Thermoactinomyces и другие. В подавляющем большинстве случаев спорогенные бактерии являются грамположительными, хотя есть и исключения. Например, Sporomusa ovata и Heliophilum fasciatum относятся к числу грамотрицательных бактерий[3].

Эндоспоры Paenibacillus alvei, визуализированные с помощью фазово-контрастной микроскопии

Основные структурные элементы зрелой эндоспоры:

• цитоплазматический компартмент, или кор;
• комбинированная клеточная стенка, состоящая из внутренней стенки и наружной стенки (кортекса);
• цитоплазматическая мембрана эндоспоры (внутренняя мембрана);
• цитоплазматическая мембрана спорангия (внешняя мембрана);
• внутренний и внешний споровые покровы;
• наружный покров (экзоспорий)[4].

Различные типы расположения эндоспор. 1, 4 — центральная эндоспора; 2, 3, 5 — терминальная (концевая) эндоспора; 6 — латеральная (боковая) эндоспора

Расположение эндоспор внутри материнской клетки может быть различным, и тип спорообразования в некоторых случаях используют при идентификации неизвестной культуры. Иногда формирующаяся эндоспора достигает таких размеров, что расширяет спорангий посередине или с одного из концов[5].

Кор эндоспоры содержит хромосому и небольшие количества компонентов аппарата трансляции: рибосомы, тРНК, сопутствующие ферменты и белковые факторы. При этом нестабильные компоненты клеток, такие как мРНК и нуклеозидтрифосфаты, отсутствуют, но есть запасы стабильных предшественников АТФ — АДФ и АМФ[6].

Сложная система покровов эндоспоры делает её высокорезистентной к различным неблагоприятным факторам. Её белковые покровы перекрывают доступ к кортексу ферментам, разрушающим пептидогликан (например, лизоциму), а также защищают спору от агрессивных химических реагентов, таких как хлороформ. Мембраны спорангия и споры создают барьер проницаемости вокруг кора, не давая пройти к нему гидрофильным соединениям массой более 300 Да. Кроме того, низкое содержание воды в коре препятствует депуринизации геномной ДНК. Катионы двухвалентных металлов (прежде всего кальция) хелатируются молекулами дипиколиновой кислоты, которые синтезируются в спорангии, а потом доставляются в кор, что обеспечивает дополнительную защиту для ДНК. В коре эндоспор некоторых бактерий имеются особые белки, связывающиеся с ДНК и защищающие её не только от депуринизации, но и от разрушения сахарофосфатного остова. Наконец, прорастание эндоспоры сопровождается интенсивной репарацией повреждений в ДНК, накопленных во время периода покоя[7].

Цикл споруляции

Цикл спорообразования протекает гораздо дольше (около 7 ч при 37 °С), чем деление с образованием других специализированных клеток. У Bacillus subtilis цикл споруляции включает семь стадий (0—VII), которые были предложены в 1960-х годах французским учёным Антуанетом Ритером.

• Стадия 0. Исходная вегетативная клетка.
• Стадия I. В настоящее время эту стадию не выделяют, так как характерных морфологических признаков она лишена, а мутанты, не способные её проходить, неизвестны.
• Стадия II подразделяется на три этапа. На этапе IIi происходит септирование: в материнской клетке образуется споровая септа и происходит асимметричное бинарное деление, при нём образуются протопласты разного размера. На этапах IIii—IIiii больший протопласт начинает поглощать меньший.
• Стадия III. Поглощение завершается, и меньший протопласт (преспора) образуется в цитоплазме большей клетки (спорангия).
• Стадия IV. Происходит синтез модифицированной клеточной стенки — кортекса, который окружает преспору.
• Стадия V. В цитоплазме спорангия откладываются белковые покровы будущей эндоспоры.
• Стадия VI. Стадия морфологически не выражена, во время неё происходит созревание эндоспоры. Она приобретает повышенную резистентность к факторам окружающей среды, входит в гиперанабиоз, становится способной к прорастанию.
• Стадия VII. Спорангий подвергается программируемой гибели и частично лизируется, из-за чего зрелая эндоспора выходит наружу[8].

Уникальная споровая септа закладывается при симметричном образовании двух Z-колец на ¼ и ¾ материнской клетки. Одно из них случайным образом выбирается при участии белка SpoIIA, второе разрушается. Далее в области Z-кольца, как при обычном делении, происходит кольцевая инвагинация мембраны, впоследствии заполняющаяся пептидогликаном. Далее он лизируется, и в результате сестринские компартменты оказываются разделёнными только двумя мембранами. Хромосома будущей эндоспоры, по последним данным, проникает в меньший компартмент после смыкания септы. Её перенос опосредует ДНК-транслоказа FtsK/SpoIIIE, формирующая в мембранах компартментов два сквозных кольцевых гексамерных канала, и C-концевые домены канальцевых белков снабжают процесс энергией АТФ. Процесс поглощения меньшего компартмента большим в целом соответствует эндоцитозу (который вообще бактериям не свойственен), его молекулярные механизмы изучены слабо[9].

Схема образования эндоспоры

В лабораторных условиях бактерии приступают к споруляции, когда в среде заканчивается легко метаболизируемый источник углерода, азота или фосфора, однако триггеры споруляции в естественной среде обитания бактерий неизвестны. Ключевое событие начала споруляции — фосфорилирование транскрипционного фактора Spo0A с помощью аутофосфорилирующих протеинкиназ. Фосфорилирование Spo0A может запускаться тремя путями:

• Через киназу KinA, которая регистрирует окислительно-восстановительный и энергетический статус клетки.
• Через снижение уровня ГДФ и ГТФ в клетке, что свидетельствует о нехватке питательных веществ.
• Через белки, связанные с чувством кворума, то есть при достижении определённой плотности популяции бактерий[10].

В условиях, не благоприятствующих споруляции, фосфорилированный Spo0A дефосфорилируется фосфатазой Spo0E. Активный фосфорилированный Spo0A активирует транскрипцию регуляторов споруляции SpoIIA, SpoIIE и SpoIIG. Клетки, содержащие фосфорилированный Spo0A, выделяют белки, убивающие соседние клетки с неактивным Spo0A, чтобы использовать при споруляции их ресурсы. Также в запуске споруляции играет роль сигма-фактор σ^H, контролирующий гены spoIIID и spoIIIM, их продукты участвуют в образовании споровой септы. После формирования септы активность Spo0A возрастает в спорангии, но снижается в преспоре. Далее в преспоре активируется сигма-фактор σ^F, а в спорангии — σ^E. Также в преспоре синтезируется σ^G, который активируется только при завершении поглощения, а в спорангии на финальных стадиях спорообразования синтезируется сигма-фактор σ^K. Совместно сигма-факторы преспоры и спорангия активируют экспрессию генов, необходимых для формирования эндоспоры[11].

Находящаяся в состоянии покоя эндоспора характеризуется гиперанабиозом и гиперрезистентностью. Она не проявляет метаболической активности, не содержит важнейших метаболитов, таких как АТФ и ацетил-CoA, находящиеся в ней ферменты неактивны. В состоянии гиперанабиоза споры могут сохранять жизнеспособность на протяжении огромного периода времени. Так, эндоспоры сибирской язвы в скотомогильниках сохраняют жизнеспособность в течение 500 лет, споры актиномицетов — до 7500 лет[12]. Имеются сведения, что споры Bacillus sp., добытые из кристаллов поваренной соли в Нью-Мексико, сохраняли жизнеспособность на протяжении 250 млн лет. Эндоспоры не погибают под действием высокой и низкой температуры, при высушивании, большом гидростатическом давлении, при УФ- и γ-излучении, под действием сильных окислителей, при повышенной кислотности и других неблагоприятных условиях[13]. Споры некоторых бактерий выдерживают даже кипячение в течение часа и более, поэтому растворы и инструменты стерилизуют в автоклавах с температурами стерилизации до 121 °C[12].

При благоприятных условиях эндоспора прорастает, то есть выходит из спорангия и превращается в нормальную вегетативную клетку. Индукторы прорастания могут быть как физиологическими (некоторые аминокислоты и сахара, пуриновые нуклеозиды и другие соединения или их смеси), так и нефизиологическими (минеральные соли, экзогенный дипиколинат кальция, лизоцим, катионные детергенты, сублетальный тепловой шок, давление от 100 до 600 МПа). Прорастание начинается через секунды после воздействия индуктора и далее от него не зависит. Сначала из эндоспоры выходят протоны, ионы калия, натрия и цинка, дипиколиновая кислота с хелатированными ионами Ca²⁺, входит вода. Далее с помощью специальных ферментов лизируется пептидогликан кортекса, продолжается регидратация, при которой кор набухает и стенка растягивается. Наконец возобновляется нормальный метаболизм и биосинтез макромолекул[14].

Эндоспоры хорошо просматриваются при помощи как светового, так и электронного микроскопа. Так как эндоспоры непроницаемы для многих красителей, их визуализируют как неокрашенные тельца на фоне остального прокрашенного содержимого бактериальной клетки. Существуют, однако, методы дифференциального окрашивания спор, с помощью которых споры становятся видны в световой микроскоп как синие тельца в розовой цитоплазме[12].

• Пиневич А. В. Микробиология. Биология прокариотов: в 3 т. — СПб.: Издательство С.-Петербургского университета, 2009. — Т. III. — 457 с. — ISBN 978-5-288-04894-4.
• Нетрусов А. И., Котова И. Б. Микробиология. — 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Издательский центр «Академия», 2012. — 384 с. — ISBN 978-5-7695-7979-0.
• Современная микробиология / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. — М.: Мир, 2005. — Т. 1. — 654 с.