Lon (протеаза)

Lon состоит из трёх доменов — а) N-концевого, функция которого до конца не известна, но, по-видимому, задействованного в распознавании субстратов[2]; б) АТФ-связывающего, осуществляющего гидролиз АТФ, разворачивание и перемещение полипептидных цепей в следующий, в) протеазный домен, где происходит расщепление субстрата на пептидные фрагменты[3]. Шесть таких белков соединяются вместе, образуя цилиндрический шестичленник-гексамер. Для расщепления полипептидная цепь должна попасть в развёрнутом виде внутрь цилиндра, где спрятан активный центр, что предотвращает действие Lon на случайные клеточные белки, не являющиеся субстратами. Напротив, белки-субстраты распознаются N-концевым доменом и перемещаются к активному центру АТФ-связывающим доменами белка[4]. Имеются данные, что два кольца-шестичленника могут соединяться вместе, составляя один большой цилиндр. Причём, похоже, соединяются они АТФ-связывающим и N-концевыми доменами, что отличает Lon от других членов группы, у которых отдельные кольца-многочленника соединены протеазными доменами. Предполагается, что шестичленник способен связывать большие белки или белковые комплексы, а двенадцатичленник — небольшие пептиды или развёрнутые белки, что позволяет регулировать протеолиз в клетке[5].

Вид сбоку на гексамер Lon. Отдельные страницы отмечены разным оттенком.

Вид сверху на гексамер Lon. Окраска в соответствии со вторичной структурой.

Кристаллическая структура Lon показывает, что в активном центре находится каталитическая диада — Ser и Lys (в отличие от большинства сериновых протеаз, где каталитическую роль играют три аминокислоты — Ser, Asp и His)[6]. Исходя из экспериментальных данных, Lon не обладает специфичностью при расщеплении субстрата, проявляя лишь незначительное предпочтение к Leu, Phe и Ala в положении -1[7].

Lon имеется почти у всех бактерий (за редким исключением), митохондриях и хлоропластах животных и растений. У некоторых бактерий (например у Bacillus subtilis) содержатся две и более формы Lon, обладающие разной функциональной специфичностью[8],[9].

У Escherichii coli Lon выполняет множество функций. Lon является основной протеазой E. coli, которая распознаёт и разрушает неправильно свёрнутые или аггрегированные белки[10][11]. В поздней стационарной фазе роста, бактериальная клетка начинает разрушать свободные белки рибосом, чтобы восполнить нехватку аминокислот. Эту функцию также осуществляет Lon[12]. Двумя наиболее известными субстратами являются SulA и RcsA. SulA является ингибиторм клеточного деления, синтезируемым в ответ на повреждение клеточной ДНК. Инактивация Lon в клетках приводит к чувствительности к ультрафиолету — клетки синтезируют SulA, он не разрушается, клетки не делятся, растут в длинные филаменты и в конце концов погибают[13]. RcsA активирует транскрипцию ферментов, синтезирующих колановую кислоту — экзополисахарид, составляющий защитную капсулу бактерии. Соответственно, самый заметный фенотипический признак отсутствия Lon — слизистые колонии на чашках Петри[14].

Escherichia coli с инактивированным Lon (слева), обычная Еscherichia coli (справа). Характерный слизистый фенотип.

Lon разрушает белки UmuD и UmuC, которые позволяют клетке синтезировать комплементарную цепь ДНК на повреждённой цепи (однако, совершая при этом множество ошибок). У UmuD Lon разрушает неактивную форму, в то время как активная форма UmuD’ разрушается ClpXP[15]. Lon разрушает оба основных структурных белка телец включения IbpA и IbpB[16]; активаторы транскрипции белков ответа на окислительный стресс SoxS и MarA[17]; а также многие из белков-антитоксинов токсин-антитоксиновых систем, включая CcdA, PemI, PasA, RelB и MazE[18][19]. У B. subtilis — два разных белка Lon: LonA и LonB. LonA участвует в инициации споруляции, в то время как LonB экспрессируется только в новообразующейся споре[9][20]; у Myxococcus xanthus один из двух генов Lon этого организма — LonD — вовлечён в регуляцию споруляции и формирование плодового тела[21]; у Proteus mirabilis Lon регулирует подвижность[22]; у Salmonella enterica, Pseudomonas syringae и Yersinia pestis — экспрессию компонентов Системы Секреции III Tипа, необходимой для взаимодействия с клетками организма хозяина[23][24][25]. В митохондриях эукариот Lon содержится в матриксе, где разрушает неправильно свёрнутые или повреждённые активными формами кислорода белки[26]. Самыми значимыми субстратами для него являются аконитаза, одна из субъединиц цитохром оксидазы и белок StAR (steroidogenic acute regulatory protein) [27][28][29].

Lon распознаёт короткие последовательности как на N- (UmuD)[30], так и на С-концах (SulA)[31] белков-субстратов. При этом какой-то общей последовательности для них не обнаружено. Сообщается, что у неправильно свёрнутых белков Lon распознаёт короткие гидрофобные участки, богатые ароматическими аминокислотными остатками[32].

Один из промотеров для транскрипции гена lon у E. coli распознаётся сигма фактором σ32, отвечающим за транскрипцию белков теплового шока. Это имеет очевидный смысл, поскольку Lon распознаёт неправильно свёрнутые белки, количество которых при тепловом шоке резко увеличено[33]. Также Lon связывается с поли-Р — полимером ортофосфата, синтезируемом в клетках E. coli в ответ на голодание. При этом меняется специфичность в сторону разрушения свободных рибосомных белков, что позволяет временно справиться с аминокислотным голодом[12]. Фаг Т4 синтезирует белок PinA, который специфически ингибирует Lon. Это вероятно говорит о том, что какие-то из важных для этого фага белков в нормальном состоянии являются субстратами для Lon[34].

Штамм BL-21(DE3), широко используемый для экспрессии рекомбинантных белков является фенотипически Lon минус, так как родительский штамм E. coliB несёт мутацию инактивирующую Lon. Предполагается, что эта мутация увеличивает выход белков склонных к аггрегации или неправильному сворачиванию[35]^,[36].

Некоторые исследователи Lon митохондрий млекопитающих предполагают, что уменьшение активности этого белка может играть существенную роль в процессе старения [37].