Двугибридный анализ

Данный метод основан на тех же принципах, что и двугибридная система, с той разницей, что белки А и Б не взаимодействуют друг с другом непосредственно. Между ними есть третий элемент — вещество Х. Этим веществом может служить молекула ДНК или РНК, малый органический лиганд, ингибитор, ковалентно связывающийся с активным центром фермента. Метод позволяет выявить НК-белковые взаимодействия, ферментативную активность по отношению к данному субстрату, взаимодействие белка с малыми молекулами[4].

Основное отличие от «прямой» двугибридной системы здесь состоит в том, что ген, экспрессия которого регулируется данной системой, является летальным. Таким образом, в случае, если взаимодействие между белками А и Б есть, гибридный организм погибнет. Данный метод используется для определения аминокислотных остатков, необходимых для осуществления взаимодействия между глобулами А и Б[4].

В данной модификации классического метода присутствует только одна рекомбинантная молекула — АД-А-Б-СД. При этом известная последовательность ДНК вставляется перед репортёрным геном, варьируется BD. Так можно определить, какие белки связываются с данной последовательностью ДНК[4].

Исторически первым для двугибридной системы организмом являются дрожжи. Дрожжи стабильный, простой и хорошо изученный модельный организм. Дрожжевые клетки поддерживают нейтральные значения pH внутри клетки, несмотря на кислые pH во внешней среде. Также дрожжи слабочувствительны к внеклеточным токсинам, ими можно манипулировать, не используя молекулярных методов[7] Важно отметить необходимость сигналов ядерной локализации, так как весь генетический аппарат дрожжей локализован в ядре. При их отсутствии потенциально взаимодействующая пара белков не будет транслирована и не провзаимодействует.

Бактериальные системы могут быть использованы аналогично дрожжевым. Они имеют заведомо больший потенциал и являются более предпочтительными для использования двугибридной системы. Бактериальные системы позволяют использовать и анализировать библиотеки размером больше 10⁸, имеют более быстрый темп роста и больший потенциал для проницаемости небольших молекул. Так же отсутствует необходимость в сигналах ядерной локализации, и появляется возможность изучать белки, токсичные для дрожжей. Ввиду более быстрых селективных методов обеспечивается низкий уровень ложных результатов (3·10⁻⁸)[6].

При исследовании взаимодействия белков, возможно выявление новых функций. С помощью одного известного белка А₀, библиотеки неизвестных белков В_n, и последующего сравнения с предварительно известной парой взаимодействующих белков A₀B₀ можно получить информацию о схожести B_n и B₀. Похожие данные можно получить путём исследования взаимодействий известной библиотеки белков с одним белком с неизвестной функцией[7].

Двугибридная система применяется в случае, когда для пары известных и взаимодействующих белков необходимо определить аминокислотные остатки, формирующие область их взаимодействия. Для этого в используемых плазмидах осуществляются мутации соответствующих специфическим аминокислотам пар оснований ДНК. Таким образом, формируется библиотека с точечными изменениями аминокислотных остатков, на основе которой с помощью двугибридной системы можно определить важность той или иной аминокислоты в формировании взаимодействия с белком-партнёром[7].

Современные методы позволяют сконструировать выбранную для исследования клетку таким образом, чтобы она отображала тот или иной молекулярный аспект, выбранный для изучения. В таких клетках становятся возможны опосредованные двугибридной системой испытания специфичности и точности доставки лекарственных препаратов, позволяющие оперативно решать проблемы возникающих побочных эффектов.

Аналогичный подход используется для токсинов и ядов[7].

Для поиска белков цинкового пальца (zinc finger proteins или ZFPs) успешно применяются методы, созданные на основе двугибридного анализа[2]. Являясь ДНК-связывающим белком, ZFP используется для создания нестандартных ДНК-связывающих доменов, которые координируются с заранее определённым участком ДНК-последовательности.

В основе метода лежит создание библиотеки ZFP за счёт случайного изменения определённых аминокислотных остатков. Далее из них отбираются те, что способны взаимодействовать с сайтом-мишенью, включённым в UAS, соответствуя требуемым характеристикам. Однако каждый ZFP распознаёт только небольшой участок ДНК, около 3-4 оснований, поэтому, для повышения точности связывания и предотвращения распознавания сайтов за пределами UAS, используется комплекс, состоящий из двух ZFP с постоянной последовательностью. ZFP из подобного комплекса связываются по краям необходимой области и предотвращают связывание вне UAS[2].

Ряд других ДНК-связывающих доменов также может быть исследован с использованием этой системы.