Бисульфитное секвенирование

Первый метод бисульфитного секвенирования описан в 1992 году[9]. Для определения паттерна метилирования использовали ПЦР, праймеры для которой были специфичными как к изменённой, так и к неизменённой бисульфитом ДНК, то есть они не содержали цитозинов, входящих в CpG-динуклеотиды. Для праймеров использовали участки, близкие к интересующему сайту метилирования, но не содержащие его. В случае, когда цитозин не был метилирован, в амплифицированной последовательности обнаруживался тимин (урацил), а в синтезированной комплементарной последовательности — аденин. Если цитозин был метилирован, то в амплифицированной последовательности он и остался, а в комплементарной синтезировался гуанин. Такой метод очень трудозатратен, поскольку требует клонирования продуктов ПЦР для достижения необходимой чувствительности. Эту же проблему можно решить при помощи вложенной ПЦР.

В пиросеквенировании используют ПЦР с праймерами, амплифицирующими как изменённую, так и не изменённую бисульфитом ДНК. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в амплифицируемой последовательности определяется по соотношению количества нуклеотидов А и Г в синтезируемой комплементарной последовательности[10][11].

Дальнейшее усовершенствование этого метода заключается в использовании аллель-специфических праймеров с однонуклеотидными полиморфизмами, позволяющих исследовать паттерны метилирования по отдельности в отцовских и материнских аллелях, что особенно полезно при изучении геномного импринтинга[12].

Этот метод основан на методе анализа одноцепочечных конформационных полиморфизмов (англ. single-strand conformation polymorphism analysis, SSCA). SSCA был разработан для выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)[13]. Фрагменты ДНК одинаковой длины, но разной нуклеотидной последовательности, с разной скоростью перемещаются в электрофорезе. Вообще говоря, SSCA недостаточно чувствителен для выявления единичной замены, но при достаточном количестве полиморфизмов неметилированных CpG-динуклеотидов в обработанной и необработанной бисульфитом ДНК будет достаточно много, чтобы чувствительности метода оказалось достаточно для определения доли метилированных цитозинов на рассматриваемом участке. Данный метод не позволяет исследовать метилированию в конкретном сайте, однако дает представление о метилировании на уровне некоторого участка или даже всего генома.

Метод высокочувствительного плавления (HRM) основан на ПЦР в реальном времени[14]. Температуру повышают с 55 до 95 °C, в результате чего комплементарные связи между цепочками разрушаются. Скорость плавления регистрируют при помощи специальных флуоресцентных красителей, и, зная зависимость флуоресценции от нуклеотидной последовательности цепочек, можно различитьоднонуклеотидные полиморфизмы. Метод не дает информации о том, какие именно CpG-динуклеотиды были метилированы и потому не изменились в процессе бисульфитной обработки, однако дает достаточно точную информацию об их количестве на интересующем участке.

Метод однонуклеотидного расширения праймера исходно был разработан для анализа однонуклеотидных полиморфизмов[15]. Применительно к анализу метилирования его используют следующим образом. На обработанной бисульфитом одноцепочечной ДНК отжигают праймеры до пары оснований, непосредственно предшествующей интересующему сайту метилирования. Затем праймер удлиняетсяпри помощи ДНК-полимеразы с использованием терминирующих её дидезоксинуклеотидов. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности определяется по соотношению количеств расширений праймеров нуклеотидами Г и А соответственно. Определить соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в исходной последовательности можно разными способами. Используют радиоактивные или флуоресцентные метки, а также пиросеквенирование[16].

Кроме того, это можно делать при помощи матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с последующим применением время-пролетного масс-анализатора (MALDI-TOF) или ион-парной обращённо-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (IP-RP-HPLC)[17].

Метод основан на использовании специфического расщепления РНК[18]. При добавлении к праймеру в ПЦР промотора РНК-полимеразы in vitro синтезируется РНК-транскрипт интересующего участка, после чего расщепляется рибонуклеазой А. Рибонуклеаза А расщепляет одноцепочечную РНК на местах расположения нуклеотидов Ц и У. Используя устойчивые к расщеплению нуклеозидтрифосфаты dUTP и dCTP, можно добиться специфического расщепления в местах расположения Ц или У. Фрагменты РНК затем анализируют при помощи MALDI-TOF. Данный метод даёт информацию о метилировании каждого из имеющихся CpG-динуклеотидов, а не только о доле метилированных нуклеотидов.

Этот метод использует праймеры, специфичные или только к преобразованной бисульфитом ДНК, или только к непреобразованной[19]. Соответственно, к первым праймерам прикрепляются только участки, которые были метилированы, а ко вторым — те, которые не были, что лишает необходимости секвенировать участки после амплификации.

Амплифицированную в MSP ДНК можно далее анализировать разными другими методами. Метод MethyLight использует MSP в реальном времени, основанную на флуоресценции][20]. Mc-MSP использует анализ кривых плавления[21]. Высокочувствительный метод плавления использует и то, и другое, и потому обладает достаточной чувствительностью для определения метилирования низкого уровня[22].

Использование ДНК-микрочипов дает возможность расширить описанные выше методы для анализа метилированности на уровне всего генома[23]. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа делают специфичными к метилированию и соответствующими интересующим CpG-сайтам. Одни комплементарны измененной бисульфитом последовательности (то есть той, в которой CpG-сайт не был метилирован), другие — неизмененной. Примером такого метода служит анализ метилирования Illumina.