Секвенирование экзома

Первый этап заключается в подготовке высококачественных препаратов геномной ДНК из предоставленных образцов путем отделения ДНК от белков, липидов и т.д. Стандартный метод выделения ДНК— экстракция смесью фенол-хлороформ[4].

Стратегии обогащения образцов позволяют селективно отбирать нужные геномные участки, то есть экзоны, из образцов ДНК до этапа секвенирования. С момента описания первого оригинального метода в 2005 году разработано несколько стратегий обогащения образцов, подходящих для целей экзомного секвенирования[5]. Выбор конкретного метода зависит от размеров интересующих участков, потребности в покрытии при секвенировании, имеющегося в наличии оборудования и других причин[6].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко применяется для амплификации требуемых фрагментов ДНК уже более 20 лет[7]. Обычно в ПЦР используют только 2 праймера, однако разработаны методы мультиплексной ПЦР, которая использует несколько праймеров и позволяет одновременно амплифицировать несколько ДНК-мишеней в ходе одного процесса. Подходы, использующие ПЦР, очень эффективны, но не позволяют работать с участками генома длиной в несколько миллионов п.о. из-за высокой цены и низкого качества получающихся образцов[1].

Метод молекулярной инверсии

Метод молекулярной инверсии — это техника, которая позволяет получить образцы ДНК, обогащенные амплифицированными инвертированными участками целевых последовательностей. Отбор нужных последовательностей происходит за счет замыкания интересующего участка в кольцо. Праймер здесь представляет собой одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид, в центральной части которого содержится универсальная последовательность с сайтами рестрикции, а концы комплементарны двум участкам геномной ДНК, между которыми находится интересующая последовательность. Образцы, не вступившие в реакцию, остаются линейными и удаляются экзонуклеазами[5][8]. Метод может быть полезен для работы с небольшим числом мишеней в большом количестве образцов. Главный недостаток — единообразие получаемых образцов, а также высокая цена при необходимости покрыть большой набор участков[7].

Для гибридизационного обогащения образцов экзомными участками создаются специальные микрочипы, содержащие закрепленные на подложке одноцепочечные олигонуклеотиды (зонды) с последовательностями из генома, способными покрыть интересующие участки. Геномная ДНК разрезается на фрагменты. Концы фрагментов делают тупыми с помощью рестриктаз, добавляют адаптеры с универсальными праймерами. После гибридизации фрагментов с зондами на микрочипах негибридизованные фрагменты отмываются с подложки, а оставшиеся затем амплифицируются с помощью ПЦР[5]. Ограничения метода связаны с дороговизной аппаратуры, количеством зондов, которые можно разместить на матрице, и необходимостью достаточно больших количеств ДНК для анализа[1].

Обогащение в растворе

В растворе синтезируется набор зондов, которые фиксируются на стрептавидиновых шариках. Шарики помещаются в раствор с фрагментированной геномной ДНК, где происходит селективная гибридизация зондов с нужными геномными участками, после чего шарики с интересующими фрагментами осаждают и отмывают. Затем оставшиеся участки секвенируют. Этот метод был разработан для усовершенствования метода гибридизационного обогащения: он позволяет создать избыток зондов к целевым участкам по сравнению с необходимым количеством образца. Оптимальный размер целевого участка ДНК — около 3,5 миллиона п.о., так при последующем секвенировании получается хорошее покрытие[7].

Основными поставщиками платформ для обогащения экзома являются NimbleGen, Agilent и Illumina[1].

В настоящее время, в дополнение к наборам, нацеленным лишь на человека, NimbleGen предлагает наборы для экзомов кукурузы, ячменя, пшеницы, сои, мыши и свиньи, а Agilent — для экзомов мыши, крупного рогатого скота и рыбок данио-рерио. Оба поставщика также предлагают возможность разрабатывать индивидуальные комплекты для других видов. Наборы для нечеловеческих видов используют протоколы и зонды, аналогичные человеческим наборам поставщиков. Оба производителя предлагают гибкий процесс проектирования, который позволяет вносить изменения для улучшения покрытия для конкретных регионов и целей[1].

Существует несколько технологий секвенирования, включая классический метод секвенирования по Сэнгеру. Методы секвенирования нового поколения используют платформы Illumina, SOLiD и Ion-Torrent. Все эти методы могут использоваться в том числе и для секвенирования экзома[14].

Первичные данные секвенирования представляют собой огромный набор небольших последовательностей (чтений), длина и качество которых зависят от технических характеристик секвенатора и способа приготовления образцов. Качество чтений можно контролировать, например, при помощи программного пакета FastQС[15]. Полученные чтения фильтруются: отрезаются концевые участки, которые часто имеют большое число ошибок, удаляются адаптерные последовательности (например, с помощью Trimmomatic[16] или sickle[17]); затем корректируются ошибки (например, с помощью программ Bloocoo[18] и Lighter[19]). Отфильтрованные чтения картируются на геном, где собираются в последовательности, соответствующие экзонам. В настоящий момент существует множество программ, которые осуществляют каждый этап подготовки данных секвенирования и их анализа, большинство из них требует больших вычислительных мощностей, так как объём получаемых данных очень велик[20].

29 сентября 2011 года компания Ambry Genetics стала первой сертифицированной компанией, предлагающей секвенирование экзома и диагностику заболеваний на его основе[22]. В компании утверждают, что результаты экзомного секвенирования позволят сотрудникам диагностировать заболевания, при которых традиционные диагностические подходы неприменимы[23].

Идентификация мутаций, вызывающих заболевания, может внести существенный вклад в диагностические и терапевтические подходы, поможет прогнозировать развитие заболевания и позволит тестировать родственников, находящихся в зоне риска[2][24][25][26][27][28]. Есть несколько факторов, на основании которых экзомному секвенированию отдается предпочтение перед моногенным анализом: возможность идентифицировать мутации в генах, не подвергшихся тестированию ввиду нетипичного клинического проявления[28] и идентификация клинических случаев, при которых мутации в разных генах вызывают различные проявления у одного и того же пациента[24]. Кроме того, метод позволяет диагностировать заболевания на ранних этапах и у молодых пациентов до проявления всего спектра характерных симптомов; он также используется для пренатальной диагностики[1] В некоторых случаях пренатальное секвенирование экзома позволяет выявить генетические заболевания, в то время как стандартные методы (кариотипирование и использование микрочипов) оказываются неэффективны[29].

Авторы важнейшей рецензированной публикации об экзомном секвенировании подчеркивают полезность этого метода для клинической практики. Авторы, применившие экзомное секвенирование для идентификации мутации, вызывающей синдром Барттера и конгенитальную хлоридную диарею, заявляют: «Мы видим будущее, в котором подобная информация станет частью повседневной клинической оценки пациентов с подозрениями на генетические заболевания с неясным диагнозом… Мы предвидим, что полноэкзомное секвенирование внесет огромный вклад в понимание того, какие гены и какими путями участвуют в развитии редких и частых человеческих болезней, а также в клиническую практику»[25].

Текущие крупные международные исследования направлены на определение в геноме частых полиморфизмов, которые легче всего идентифицировать современными методами. Однако из-за отрицательного отбора полиморфизмы, вызывающие крайне тяжелые заболевания, в частности, менделевские болезни, встречаются с существенно меньшей аллельной частотой и могут остаться невыявленными в ходе поиска генов-кандидатов при использовании современных стандартных методов генотипирования, при этом чаще всего они расположены в границах экзома. Так как при комплексных расстройствах с риском заболевания связано большое количество генов, для обнаружения их необходимы исследования очень большой выборки, поэтому, с точки зрения издержек, полногеномное секвенирование не является оптимальным. К тому же, полиморфизмы в кодирующих областях изучаются очень подробно, и их функциональное значение проще определить[30] Успешная модель идентификации менделевских генов включает определение возникающих de novo полиморфизмов при секвенировании генов двух родителей и потомка[31].

Геномы растений могут быть чрезвычайно сложными, повторяющимися и часто полиплоидными; в результате некоторые из наиболее экономически важных культур не удается исследовать с использованием полногеномного секвенирования. Разработан набор для обогащения экзома пшеницы на основе накопленных данных транскриптома[32], с использованием которого были проведены исследования нежелательной внутрикультурной генетической гетерогенности экзома, влияющей на фенотип растения, в частности, скорость роста, способность жить в различных условиях и другие важные для селекции признаки. Подобные же наборы были использованы при исследовании риса Oryza sativa[33] и сои Glycine max[34]. Также можно идентифицировать генетические маркеры, отвечающие за особую устойчивость растительных культур к определенным патогенам[35].

В ряде случаев секвенирование экзома может быть использовано как альтернатива более дорогому секвенированию полного генома, например, при исследовании генетических вариаций внутри и между популяциями[36].