GENCODE

Задача определения понятия «ген» стоит перед учеными на протяжении всего времени с тех пор, как исследователи задумались о вопросах наследственности. В 1900-х годах ген рассматривался как некая дискретная единица наследственности, затем ген стали считать основой для биосинтеза белка, а в последнее время это понятие расширили до геномного фрагмента, транскрибирующегося в РНК[13]. Хотя определение гена претерпело значительные изменения за последний век, оно осталось сложным и противоречивым предметом обсуждения для многих ученых. В ходе развития проектов ENCODE и, в частности, GENCODE, были подробнее описаны ещё более проблематичные аспекты определения — такие как альтернативный сплайсинг, межгенные участки, а также сложные паттерны рассеянной регуляции, консервативность некодирующих участков и обилие генов, продуцирующих некодирующие РНК. Поскольку глобальной целью проекта GENCODE является создание энциклопедии генов и генных вариантов, эти проблемы поставили проект перед необходимостью дать обновленное определение понятия гена[13].

Псевдогены — это белок-кодирующие (или сходные с ними) последовательности ДНК, в которых произошла делеция или сдвиг рамки считывания[14]. В большинстве геномных баз данных их упоминают как побочные продукты аннотации более привычных белок-кодирующих последовательностей. Однако недавний анализ показал, что некоторые из псевдогенов не просто экспрессируются, но и функционируют, играя роль в различных биологических процессах[15]. Чтобы разобраться со всеми сложностями описания псевдогенов, в рамках GENCODE исследователи создали онтологию псевдогенов с использованием автоматических, ручных и экспериментальных методов, чтобы связать воедино их различные свойства, в том числе свойства последовательности, эволюцию и возможную биологическую функцию[4]. Количество аннотированных псевдогенов растет с каждой новой версией GENCODE (см. Основная статистика).

Одной из ключевых областей исследования проекта GENCODE является изучение биологического значения длинных некодирующих РНК (lncRNA). Для более глубокого понимания и изучения экспрессии lncRNA у человека, в рамках GENCODE был запущен подпроект для разработки пользовательских микрочипов для количественного определения таких транскриптов в аннотации lncRNA[6]. Некоторое количество подобных платформ было создано с помощью системы Agilent Technologies eArray, они доступны в стандартном формате Аgilent[16].

Датасет длинных некодирующих РНК, представленный в GENCODE (в частности, в версии GENCODE 7), считается самым большим из всех представленных датасетов lncRNA. При этом он мало перекрывается с другими существующими датасетами[6]. Транскрипты, аннотированные как lncRNA, далее могут быть классифицированы на следующие типы на основе их положения в геноме относительно белок-кодирующих генов:

1. Антисмысловая РНК: локус, для которого был найден хотя бы один транскрипт, перекрывающийся с экзоном белок-кодирующего гена на противоположной цепи, или есть опубликованные данные об антисмысловой регуляции какого-либо гена;
2. Длинная межгенная некодирующая РНК (lincRNA[17]);
3. «Перекрывающийся»: локус, содержащий белок-кодирующий ген внутри интрона на той же цепи;
4. «Интронный»: локус, расположенный внутри интрона, но не перекрывающийся с экзонами на той же цепи;
5. Процессированный транскрипт: локус, для которого ни один транскрипт не содержит открытую рамку считывания, и который не может быть отнесен ни к одной из предыдущих категорий из-за сложной структуры.

Сравнительная статистика четырёх основных релизов GENCODE продемонстрирована на графике справа[20].

Данные свидетельствуют о том, что покрытие генома (количество обнаруженных и аннотированных локусов) стабильно увеличивается. При этом доля белок-кодирующих генов среди аннотированных уменьшается — в основном, из-за результатов аннотирования поли(A)-сайтов и кэп-анализа экспрессии генов (CAGE)[4]. Одновременно с этим увеличивается количество псевдогенов и локусов, аннотированных как длинные некодирующие РНК.

Информация о транскриптах Ensembl, полученных при автоматической аннотации генов, основывалась на экспериментальных данных о последовательностях белков и мРНК из публичных баз данных[22]. Помимо белок-кодирующих участков, аннотировались нетранслируемые участки, длинные некодирующие РНК и короткие некодирующие РНК[4].

Схема, по которой происходит аннотация локусов GENCODE[23]

HAVANA (Human and Vertebrate Analysis and Annotation) — исследовательская группа, осуществляющая ручную аннотацию транскриптов в проекте GENCODE[3][4].

Помимо группы HAVANA, в состав консорциума GENCODE входило ещё несколько групп, проводивших анализ аннотированных локусов с помощью программ Ensembl и помогавших аннотаторам в идентификации пропущенных либо неверно аннотированных локусов, в том числе сайтов сплайсинга. Для обмена информацией между группами использовалась трекинговая система AnnoTrack[24]. В процессе также использовались данные экспериментов РНК-секвенирования, CAGE и Ditag[25].

Помимо официально вовлечённых в проект групп, над улучшением качества аннотации GENCODE работали независимые исследователи[26].

При объединении все модели транскриптов, полученные автоматической и ручной аннотацией, сравнивались для перекрывающихся транскриптов. Найденные расхождения детектировались с использованием системы AnnoTrack[4].

Автоматическая аннотация не всегда может считаться корректной (так, только в 45 % случаев автоматической аннотации корректно предсказываются все альтернативные транскрипты[4]). В случае несовпадения аннотаций приоритетной являлась аннотация HAVANA, так как ручная аннотация в сложных случаях предполагала анализ геномного контекста, литературы и использование экспериментальных данных Mus musculus. Тем не менее, для таких случаев сохраняется информация, полученная обоими способами аннотации[4].

Транскриптам присваивается определённый уровень поддержки на основании сравнения транскрипта GENCODE с выравниванием мРНК и маркерных экспрессирующихся последовательностей (EST), полученным из Ensembl и UCSC. В итоге аннотации каждого транскрипта делятся на определённые вручную, автоматически или слитые аннотации, то есть те, для которых и автоматический метод, и метод аннотирования вручную дали одинаковые результаты[4].

С помощью амплификации кДНК были сгенерированы двуцепочечные кДНК человеческих тканей (мозга, сердца, почки, яичка, печени, селезёнки, лёгкого и скелетной мышцы). Очищенная ДНК использовалась для создания геномной библиотеки с помощью набора Illumina «Genomic DNA sample prep kit». Библиотека была отсеквенирована на платформе Illumina Genome Analyzer 2. Риды (по 35 или 75 нуклеотидов) картировались на референсный геном человека сборки hg19 и предсказанные ампликоны с использованием программы Bowtie. Транскрипты валидировались только ридами, которые однозначно картировались на геном. Места соединений экзонов считались достоверными, если на них картировалось минимум 10 ридов, содержащими хотя бы 4 (для ридов длиной 35 нуклеотидов) или 8 (для ридов длиной 75 нуклеотидов) нуклеотидов в каждом из двух экзонов, разделённых сайтом сплайсинга[4].

Для аннотации альтернативных транскриптов генов использовался веб-сервис APPRIS (CNIO). APPRIS выбирает один вариант в качестве «главной изоформы» на основании информации о белковом продукте гена и об ортологах близких видов. APPRIS широко использовался при масштабировании проекта ENCODE и при аннотации геномов других видов (Mus sp., Danio sp., Rattus sp.)[27].

Для поиска кодирующих последовательностей в транскриптах, автоматически предсказанных на основании данных РНК-секвенирования, использовалась программа PhyloCSF. Она основывается на анализе паттернов эволюции, выравнивая транскрипт с экзонами позвоночных из UCSC (включая 33 плацентарных млекопитающих)[4].

Все гены датасета GENCODE классифицируются на три категории в соответствии с типом аннотации[4]:

• Уровень 1 (подтвержденный локус): включает транскрипты, которые были аннотированы вручную и проверены экспериментально с помощью RT-PCR — секвенирования, а также псевдогены, подтвержденные тремя разными методологиями[4].
• Уровень 2 (аннотированный вручную локус): к нему относятся транскрипты, аннотированые только вручную группой HAVANA, а также транскрипты, совмещенные с моделями, полученными по автоматическому протоколу Ensembl[4].
• Уровень 3 (автоматически аннотированный локус): отражает транскрипты или псевдогены, предсказанные только с помощью автоматической аннотации Ensembl[4].

Генам и транскриптам присваиваются статусы «известный», «новый» и «предполагаемый» в зависимости от их представленности в других основных базах данных и от оснований, использованных для построения составляющих их транскриптов[4].

Известный («known»): представлен в базах данных HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) и RefSeq[4].

Новый («novel»): не представлен в базах HGNC или RefSeq, но хорошо подтверждается либо транскриптом, специфичным для данного локуса, либо свидетельствами его присутствия в паралогичном или ортологичном локусе[4].

Предполагаемый («putative»): не представлен в базах НGNC или RefSeq, но подтверждается признаками существования более короткого и редкого транскрипта[4].

Проект Ensembl является важной частью проекта ENCODE и представляет собой геномный браузер, позволяющий визуализировать сборку генома и все данные проекта ENCODE, в частности, аннотированные в проекте GENCODE геномные участки[28].

RGASP (The RNA-seq Genome Annotation Assessment Project) — проект, организованный в рамках консорциума GENCODE после семинара EGASP (ENCODE Genome Annotation Assessment Project) по предсказанию генов. Было проведено две сессии семинаров для анализа результатов секвенирования РНК, а также рассмотрения его различных (методических и технических) аспектов. Одной из наиболее существенных находок первых двух стадий проекта стала важность соотнесения чтения с качеством полученного предсказания гена. В 2014 году была проведена третья сессия семинаров RGASP, где основное внимание было уделено картированию чтений на геном. Проект предоставил софт для аннотации транскриптов (определение, реконструкция и расчет количества транскриптов)[29].