Позиционирование нуклеосом

Позициони́рование нуклеосо́м — определение положения нуклеосом на последовательности ДНК эукариот. Участки ДНК могут либо входить в нуклеосомные комплексы, либо быть в составе линкерной, межнуклеосомной ДНК. Эта характеристика ДНК определяет её доступность для взаимодействия с белками.

Начало развития метода

Разработка методов по позиционированию нуклеосом берет своё начало в 1973 году, тогда было показано свойство ядерного хроматина под действием эндогенных нуклеаз расщепляться на серию отдельных фрагментов ДНК приблизительно равной длины. Первоначально в экспериментах в качестве нуклеазы использовалась дезоксирибонуклеаза I, впоследствии широкое распространение получила микрококковая нуклеаза[1].

Позиционирование нуклеосом при использовании микрококковой нуклеазы

Классический подход

Экспериментальный метод определения участков ДНК, входящих в состав нуклеосом, основан на применении микрококковой нуклеазы (метод MNase-seq). Клетки замораживают и измельчают, дают оттаять. После оттаивания содержащий хроматин гомогенат обрабатывают микроккоковой нуклеазой. Нуклеаза расщепляет линкерные, не защищённые нуклеосомами участки ДНК. При помощи протеаз и РНКаз раствор очищают от белков и РНК. ДНК экстрагируется из раствора. Применяется как колоночная хроматография, так варианты жидкостной экстракции — фенол-хлороформная экстракция[2].

ДНК осаждается этанолом. Не все линкерные участки могли расщепиться нуклеазой. На этой стадии ДНК-продукт состоит из смеси ДНК фрагментов, соответствующих участкам, с различным покрытием нуклеосомами. Фрагменты ДНК разделяются по размеру электрофорезом на агарозном геле. ДНК экстрагируется из полоски геля, содержащей мононуклеосомный продукт. Полученные фрагменты ДНК приготавливают к секвенированию. Распространено применение высокоэффективной технологии SOLiD. В результате секвенирования получают библиотеку ДНК-фрагментов. Фрагменты картируются на геном. По величине покрытия различных участков генома судят о расположении нуклеосом по последовательности ДНК[3][4].

Использование именно микроккоковой нуклеазы обусловлено тем, что она обладает как эндонуклеазной, так и экзонуклеазной активностями. Нуклеаза разрезает ДНК и последовательно отщепляет нуклеотиды со свободных концов. Недостатком микроккоковой нуклеазы является предпочтение ею, как эндонуклеазы, сайтов, составленных из чередующихся нуклеотидов dA и dT, следующими за dC или dG. В то же время она плохо распознаёт сайты из только повторяющихся dA или dT (4—6). Как экзонуклеаза микрококковая нуклеаза медленнее отщепляет нуклеотиды dC и dG. Работа фермента сильно тормозится на участках ДНК, взаимодействующих с белками. При большом времени выдержки нуклеаза начинает щепить и нуклеосомную ДНК, преимущественно в местах близости к поверхности нуклеосомы. Работа фермента в эксперименте останавливается добавлением раствора ЭДТА[5].

Метод MNase-seq может дополняться ультразвуковым разрушением и/или иммунопреципитацией гистона H3 (ChIP-seq), а также использованием таких ферментов, как ДНКаза (DNase-seq), транспозаза (ATAC-seq) и CpG-метилтрансфераза (NOME-seq). Может использоваться непосредственное химическое разрушение ДНК между нуклеосомами, например, при помощи гидроксильного радикала или малых ароматических молекул вроде метидиумпропил-ЭДТА, который внедряется в двойную спираль ДНК преимущественно в участках между нуклеосомами и разрушает её в присутствии катионов Fe2+ (метод MRE-seq)[6].

Позиционирование нуклеосом in vitro

При изучении различных факторов, влияющих на распределение нуклеосом по ДНК, обычно стараются выделить компоненту влияния собственно последовательности нуклеотидов. Для этого комплекс ДНК с белками гистонами собирается in vitro из предварительно очищенной от белков ДНК и гистоновых октамеров. Количества ДНК и гистонов берутся в определённом соотношении, приблизительно один гистоновый октамер на 850 пар оснований. Далее производятся те же манипуляции, что и в обычном методе с использованием микроккоковой нуклеазы[3].

Предсказание сайтов связывания нуклеосом

В настоящее время развиваются методы позиционирования нуклеосом методами биоинформатики. Основа методов — экспериментально выявленные закономерности распределения нуклеосом в различных областях генома, и зависимости этих распределений от последовательности нуклеотидов ДНК[7]. Данные по результатам экспериментального картирования нуклеосом собраны в базе данных NPRD (англ. Nucleosome Positioning Region Database)[8].

Примечания
  1. Hewish D. R., Burgoyne L. A. Chromatin sub-structure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease. (англ.) // Biochemical and biophysical research communications. — 1973. — Vol. 52, no. 2. — P. 504—510. — PMID 4711166.
  2. Rizzo J. M., Sinha S. Analyzing the global chromatin structure of keratinocytes by MNase-seq. (англ.) // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). — 2014. — Vol. 1195. — P. 49—59. — doi:10.1007/7651_2014_77. — PMID 24676786.
  3. Valouev A., Johnson S. M., Boyd S. D., Smith C. L., Fire A. Z., Sidow A. Determinants of nucleosome organization in primary human cells. (англ.) // Nature. — 2011. — Vol. 474, no. 7352. — P. 516—520. — doi:10.1038/nature10002. — PMID 21602827.
  4. Valouev A., Ichikawa J., Tonthat T., Stuart J., Ranade S., Peckham H., Zeng K., Malek J. A., Costa G., McKernan K., Sidow A., Fire A., Johnson S. M. A high-resolution, nucleosome position map of C. elegans reveals a lack of universal sequence-dictated positioning. (англ.) // Genome research. — 2008. — Vol. 18, no. 7. — P. 1051—1063. — doi:10.1101/gr.076463.108. — PMID 18477713.
  5. Clark D. J. Nucleosome positioning, nucleosome spacing and the nucleosome code. (англ.) // Journal of biomolecular structure & dynamics. — 2010. — Vol. 27, no. 6. — P. 781—793. — doi:10.1080/073911010010524945. — PMID 20232933.
  6. Teif V. B. Nucleosome positioning: resources and tools online. (англ.) // Briefings in bioinformatics. — 2015. — doi:10.1093/bib/bbv086. — PMID 26411474.
  7. Xi L., Fondufe-Mittendorf Y., Xia L., Flatow J., Widom J., Wang J. P. Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model. (англ.) // BMC bioinformatics. — 2010. — Vol. 11. — P. 346. — doi:10.1186/1471-2105-11-346. — PMID 20576140.
  8. Levitsky V. G., Katokhin A. V., Podkolodnaya O. A., Furman D. P., Kolchanov N. A. NPRD: Nucleosome Positioning Region Database. (англ.) // Nucleic acids research. — 2005. — Vol. 33. — P. D67–70. — doi:10.1093/nar/gki049. — PMID 15608285.

Ссылки

This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.