Нанопоровое секвенирование

В данном методе цепи нуклеиновых кислот не расщепляются. Перенос целых молекул ДНК и РНК через пору может осуществляться следующими способами:

• Транспорт под действием напряжения. Так как ДНК и РНК несут на себе отрицательный заряд, то самым простым способом транспорта молекулы нуклеиновой кислоты через пору является их электрофоретический перенос вместе с ионами. Проблемой данного метода является то, что для измерения падения тока ионов через пору изначально требуется большой ток, чтобы получить хорошее соотношение сигнал/шум. Но при увеличении приложенного напряжения увеличивается и скорость, с которой молекула нуклеиновой кислоты преодолевает пору, а значит уменьшается время распознавания каждого отдельного основания, из-за чего качество распознавания падает[21].

• Транспорт под действием напряжения с расплетанием дуплексов. Уменьшить скорость прохождения одноцепочечной ДНК через пору можно, образуя с ней двухцепочечные участки с помощью комплементарных фрагментов ДНК. Тогда в ходе транспорта будет происходить расплетание данного участка, что и позволит дольше задерживать отдельные нуклеотиды в поре. Тем не менее, поскольку расплетание происходит не понуклеотидно, то время задержки нуклеотида в поре не является постоянным для всей последовательности[21].

• Транспорт с использованием ферментов. Для того, чтобы каждый нуклеотид задерживался в поре на фиксированное время, можно использовать различные ферменты, которые будут пропускать нуклеотиды через пору по одному. Примером такого фермента является ДНК-полимераза. За счёт приложенного напряжения комплекс ДНК-фермент изначально притянут к поре. Но теперь, прежде, чем очередной нуклеотид молекулы ДНК пройдёт через пору, должен произойти один шаг синтеза второй цепи ДНК. Возникающая задержка оснований внутри поры позволяет более точно различать их[21].

В данном методе цепь нуклеиновой кислоты нарезается на единичные нуклеотиды экзонуклеазой, расположенной в непосредственной близости от поры. Под действием поля отрицательно заряженные нуклеотиды самостоятельно попадают в пору, где происходит определение оснований[21].

Альфа-гемолизин Staphylococcus aureus — это водорастворимый мономер, который в мембране самопроизвольно образует гептамер. Трансмембранный домен состоит из ствола и головки поры. Головка поры содержит полость диаметром около 4,5 нм. В месте соединения ствола и головки находится сужение канала шириной 1,5 нм. Ствол поры состоит из 14 антипараллельных бета-тяжей, формирующих сквозной канал шириной около 2 нм. При нейтральном pH многие аминокислотные остатки в поре заряжены (например, положительно заряженный остаток лизина K147 и отрицательно заряженный остаток глутамата E111). В 1 М растворе KCl на поре держится потенциал в 120 мВ (от ствола к головке), что обуславливает ток 120 пА[22]. Внутри ствола находится три сайта распознавания нуклеотидов, что в теории делает возможным распознавание одного нуклеотида более чем одним сайтом (что увеличит точность прочтения)[23].

Порин A Mycobacterium smegmatis (англ. Mycobacterium smegmatis porin A, MspA) — нанопора диаметром 1,2 нм. Обладает структурными особенностями (формой и диаметром поры), которые улучшают соотношение сигнал/шум при секвенировании ДНК по сравнению с альфа-гемолизином[24]. Однако у MspA есть и существенный недостаток: отрицательно заряженное ядро мешает продвижению одноцепочечной ДНК внутри поры. Поэтому для секвенирования в изначальном белке три отрицательно заряженных остатка аспартата были заменены на нейтральные остатки аспарагина[25].

Моторный белок упаковки ДНК бактериофага phi29 участвует в упаковке ДНК в капсид вирусов, а также в выходе ДНК из капсида при инфицировании. Ключевым отличием от вышеупомянутых белков является то, что имея больший диаметр канала (от 3,6 нм до 6 нм), он способен пропускать двухцепочечную ДНК. Из-за своей природы моторный белок phi29, в отличие от других пор, в своей исходной форме не встраивается в мембрану, однако эта проблема решается модификацией белка[26]. Другие модификации позволяют белку пропускать одноцепочечную ДНК или одноцепочечную РНК[27].

Помимо белковых нанопор также используются твердотельные нанопоры небиологической природы. Для анализа нуклеиновых кислот используют нанопоры в подложках из кремния, нитрида кремния и полиэтиленимина[27]. Обычно поры формируются пучками ионов или электронов, что позволяет легко варьировать их размер[28]. Отдельно стоит выделить материалы, формирующие очень тонкие — «2D»-поры: графен, дисульфид молибдена и другие[27]. Графен обладает и предельно маленькой толщиной, что способствует увеличению пространственного разрешения вдоль ДНК, и одновременно с этим прочностью, химической инертностью и электропроводимостью. Эти свойства способствуют применению данных материалом в нанопоровом секвенировании[28].

Являясь тонкой и ион-непроницаемая структурой, графен представляет собой хороший материал для секвенирования на основе нанопор. Так, было продемонстрировано, что нанопоры графена можно использовать в качестве электрода для измерения тока, протекающего через нанопоры между двумя камерами, содержащими ионные растворы[28].

В 2010 году был разработан метод твердотельного наносеквенирования, основанный на детекции флуоресцентного сигнала. Сначала нужная ДНК конвертируется в ДНК, в которой каждому изначальному основанию соответствует короткая последовательность. На эти короткие последовательности гибридизуются флуоресцентные зонды (молекулярные маяки), при этом конец одного зонда гасит флуоресценцию флуорофора на начале другого зонда. При этом для кодирования четырёх оснований нужно всего два типа зондов: каждому основанию (а точнее, соответствующей ему короткой последовательности) соответствует два флуоресцентных сигнала (00, 01, 10 или 11, где 0 соответствует одному цвету, а 1 — другому). При прохождении через пору получившаяся двухцепочечная ДНК расплетается, зонд отделяется, соответственно флуорофор на следующем зонде начинает светиться[29][30].

К преимуществам метода относится точность сигнала — камеры регистрирует сигнал гораздо точнее других имеющихся техник. Однако метод требует предварительной обработки образца: конвертации каждого нуклеотида в примерно 12 нуклеотидов (что также удлиняет саму ДНК)[29].

Твердотельные нанопоры лишены некоторых недостатков биологических нанопор: чувствительности к pH, температуре, концентрациям электролита, механическим воздействиям и т. д. Помимо этого, они стабильнее, дольше служат, получить разнообразие форм и размеров таких пор значительно проще, а технология производства сходна с производством полупроводников, что сильно облегчает процесс получения таких пор и делает потенциально возможным совмещение с другими наноустройствами. К преимуществам биологических нанопор можно отнести возможность химической или генетической модификации, химическую специфичность к ДНК или РНК и относительно низкую скорость прохождения ДНК или РНК сквозь пору[28][31].

Для получения нанопор может быть использована технология ДНК-оригами. Впервые такая возможность была продемонстрирована в 2012 году, когда с помощью ДНК-оригами была получена структура, похожая на альфа-гемолизин. Полученная структура самопроизвольно встраивалась в мембраны[27].

В 2010 году было показано, что однослойные углеродные нанотрубки также могут встраиваться в мембраны и пропускать ДНК[27].

На 2020 год твердотельные нанопоры не обладают химической специфичностью белков, поэтому активно изучается возможность интеграции белковых нанопор в твердотельных подложках[28].

Другим перспективным направлением является использование твердотельных нанопор с сенсорами (ёмкостными датчиками, туннельными электронными и другими детекторами)[28].

В феврале 2012 года на конференции AGBT во Флориде компания Oxford Nanopore Technologies представила прототипы двух платформ для высокопроизводительного секвенирования длинных фрагментов, основанных на нанопоровом секвенировании целых цепочек: GridION и MinION. В качестве демонстрации был секвенирован геном бактериофага PhiX длиной 5386 п. о.[19] На 2020 год компания выпускает несколько устройств. Все они позволяют анализировать данные в реальном времени[33]

MinION — секвенатор небольшого размера с одноразовой ячейкой, спроектированный для использования в домашних условиях, с запланированной ценой около 900$. Секвенатор имеет разъём USB 3.0 для подключения к компьютеру. Содержит 512 нанопор со сходными характеристиками[2]. Ячейка позволяет отсеквенировать до 30 миллионов п. о. ДНК (примерно за двое суток можно оцифровать 10—20 миллионов п. о. ДНК)[34]. В 2019 году компания начала выпускать Flongle — адаптор к MinION или GridION, который позволяет работать с менее производительными (~1 Gb, 126 нанопор вместо 512), но существенно более дешёвыми ($90) ячейками[35] .

GridION — устройство, спроектированное для полногеномного секвенирования (по сути своей — MinION с увеличенной производительностью). Прототип имел 2000 отдельных нанопор, каждая из которых способна получать прочтения длиной до 5100 п. о. со скоростью 150 миллионов п. о./ч в течение 6 часов[2]. GridION Mk1 стоит $49,955 и содержит 5 независимых ячеек. С помощью него за один эксперимент можно отсеквенировать до 150 миллионов п. о. ДНК[36].

Самый высокопроизводительный секвенатор этой компании, позволяет секвенировать за один эксперимент несколько триллионов п. о. ДНК. PromethION 24 содержит 24 ячейки и способен за трое суток оцифровать 3,8 триллионов п. о. ДНК, PromethION 48 содержит 48 ячеек и способен за трое суток оцифровать 7,6 триллионов п. о. ДНК. Ячейки секвенатора содержат 3000 нанопор[37]. Поток данных с такого количества нанопор не может анализироваться обычным компьютером, поэтому для использования этого секвенатора необходим суперкомпьютер (впрочем, если запускать только одну ячейку, то справится и обычный компьютер)[37][38].

Компания планирует выпустить ещё два устройства: SmidgION — секвенатор, который подключается к смартфону, и Plongle — секвенатор, который содержит 96 независимых, но малопроизводительных ячеек, и, соответственно, рассчитан на частые секвенирования большого объёма коротких ДНК[39].

После использования продукции Oxford Nanopore на выходе имеются сырые данные формата FAST5. Формат FAST5, используемый Oxford Nanopore, — это вариант стандарта HDF5 с иерархической внутренней структурой, предназначенной для хранения метаданных, связанных с последовательностью ДНК и событий (агрегированные измерения общего тока), предварительно обработанных рабочим устройством. Результаты обработки отображаются в реальном времени в графическом интерфейсе MinKNOW, а данные записываются в формате файлов FASTQ или .fast5[40]. Далее нужно произвести распознавание нуклеотидов (англ. base calling). Этот процесс обработает сырые данные формата FAST5 в формат FASTQ (в программе MinKNOW этот процесс можно запустить во время прочтения ридов). Также можно использовать такие программы, как poreTools[41], Guppy[42][43].

Далее нужно очистить полученные последовательности, чтобы избавиться от данных со слишком большим шумом. Для этой задачи используется, например, программа NanoFilt[44][45]. Как только данные будут очищены, полученные данные дальше можно использовать для последующей сборки и анализа данных[43].