Терапевтический ангиогенез

Потребность в терапевтическом ангиогенезе сосредоточена в области дистальных форм хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК), ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, при которых хирургические методы лечения либо невыполнимы, либо недостаточно эффективны, сопряжены с высокой частотой противопоказаний и осложнений [2][3].

Концепция терапевтического ангиогенеза начала развиваться после работ J.Folkman, который разработал теорию о развитии и поддержании адекватного кровоснабжения с помощью ангиогенных факторов роста в опухолевых тканях.
После выявления факторов роста кровеносных сосудов исследователи стали проверять гипотезы по стимулированию ангиогенеза в терапии ишемических состояний. Впервые в клинической практике терапевтический ангиогенез применил J.Isner. В 1994 году 71-летней пациентке в тяжелом состоянии с критической ишемией нижних конечностей (КИНК), IV степень ишемии по классификации А. В. Покровского-Фонтейна, был введен ген VEGF-165 в плазмидном векторе[4][5].
Следующим исследователем-клиницистом была I. Baumgartner, которая провела ряд исследований у пациентов с КИНК, описала и классифицировала возможные побочные явления[6].

Условно выделяют два процесса, лежащие в основе терапевтического ангиогенеза: ангиогенез и васкулогенез[7].
Васкулогенез представляет собой процесс формирования кровеносных сосудов из эндотелиальных клеток-предшественников (endothelial progenitor cells, EPCs — клетки) in situ, которые мигрируют и сливаются с другими эндотелиальными клетками-предшественниками в капилляры и дифференцируются в клетки эндотелия, формируя новые сосуды. Данная форма наиболее распространена в эмбриональный период[8].
Ангиогенез включает в себя продление уже сформированных сосудов и представляет собой процесс прорастания новых капилляров, включающий активацию эндотелиальных клеток, деградацию межклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию эндотелиоцитов и образование первичных высокопроницаемых сосудистых структур. В последующем происходит стабилизация и «взросление» первичных сосудистых структур за счет привлечения клеток другого типа: перицитов и гладкомышечных клеток, в результате чего происходит организация сложной трехмерной сосудистой сети[8].
Основным стимулирующим фактором ангиогенеза при физиологических и патологических состояниях является недостаток кислорода. Гипоксия стимулирует образование большинства ангиогенных факторов, и, прежде всего, основного регулятора ангиогенеза как в эмбриональном, так и в постнатальном периоде развития организма — фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor, VEGF) и его рецепторов (VEGF-R). Выделено более 20 факторов, стимулирующих или подавляющих процесс ангиогенеза (таблица 1). Некоторые факторы, в зависимости от дозы, могут быть как индукторами ангиогенеза, так и ингибиторами[9][10]. В настоящее время термин «терапевтический ангиогенез» подразумевает оба, выше описанных процесса роста новых кровеносных сосудов[11][12][13].

Таблица 1 — «Индукторы и ингибиторы ангиогенеза»

Для процесса терапевтического ангиогенеза используются различные терапевтические подходы:

• введение рекомбинантных белков — индукторов ангиогенеза (факторов роста);
• использование клеточной терапии;
• введение генных конструкций, кодирующих факторы.

Зная детально физиологические эффекты фактора роста эндотелия сосудов и имея положительный опыт применения белковых факторов стимуляторов гемопоэза, ученые синтезировали белковые молекулы фактора роста эндотелия сосудов и основного фактора роста фибробластов (bFGF).
Первые неконтролируемые клинические исследования у больных ИБС и больных с критической ишемией нижних конечностей (КИНК), в которых использовали рекомбинантные белки, показали обнадеживающие предварительные результаты по эффективности. Однако данные двойных слепых плацебо-контролируемых исследований оказались менее оптимистичными. В двух больших исследованиях, в которых тестировали внутрикоронарное введение рекомбинантных факторов роста (VEGF в исследовании VIVA у 178 больных ИБС, не являющихся оптимальными кандидатами для хирургической или эндоваскулярной реваскуляризации; FGF-2 в исследовании FIRST у 337 аналогичных больных) не удалось обнаружить различий с результатами в группах плацебо.
В исследовании TRAFFIC (FGF-2 двукратно вводили в бедренную артерию больным с КИНК), в котором более выраженное увеличение времени безболевой ходьбы у получавших FGF-2 в первые 3 мес. нивелировалось через 6 мес. за счет увеличения времени безболевой ходьбы в группе получавших плацебо. Тем не менее, результаты этого исследования вселили некоторый оптимизм относительно возможности использования рекомбинантного FGF-2 при КИНК.
Возможно, неудачи контролируемых исследований по терапевтическому ангиогенезу с помощью рекомбинантных факторов роста были обусловлены неправильно выбранным способом введения фактора. Рекомбинантные белки имеют короткий период полужизни в кровотоке, к тому же показано, что при внутрисосудистом способе введения очень небольшая часть белка задерживается в миокарде(0,1 % при внутривенном введении и 5 % при внутрикоронарном). Для эффективного использования рекомбинантных факторов роста необходимо их локальное введение в миокард или скелетные мышцы в виде комплексов с матриксными белками, обеспечивающими длительное локальное высвобождение фактора[14].

Рисунок 1.
Неоваскуляризация: ангиогенез и васкулогенез. Isner J., Vale P., Losordo D. and el. Angiogenesis and cardiovascular disease. Dialogues in сardiovascular medicine. 2001; 3: 145—170.

Формирование новых сосудов в настоящее время рассматривается как два взаимосвязанных процесса — ангиогенез и васкулогенез. Васкулогенез включает в себя участие костномозговых предшественников эндотелиальных клеток (EPCs — endothelial progenitor cells), которые перемещаются к месту образования нового сосуда, где уже на месте дифференцируются в эндотелиальные клетки. Наиболее хорошо изученным методом клеточной терапии ишемических заболеваний конечностей является стимуляция выхода в кровеносное русло EPCs клеток, выделение их из кровеносного русла и введение в область ишемии. На основании анализа проведенных доклинических и ряда клинических исследований можно сделать заключение, что введение предшественников эндотелиоцитов или стимуляция выхода предшественников эндотелиальных клеток ускоряет формирование коллатеральных сосудов, минимизируя при этом зону ишемического повреждения. Однако процесс требует наличия специально оснащенной лаборатории, а количество получаемых клеток обычно варьируется.
Механизм ангиогенного действия стволовых клеток (СК), полученных из взрослого организма, включает предположительно паракринные эффекты, связанные с секреторной активностью клеток и дифференцировку их в специфические клетки сосудов, а также слияние с клетками тканей. Удельный вес каждого из этих механизмов до конца не определен и экспериментальные данные довольно противоречивы. Однако в значительной степени стимуляция неоваскуляризации при введении СК осуществляется за счет их секреторной активности. Это подтверждается тем фактом, что увеличение количества сосудов в миокарде экспериментальных животных отмечалось при введении практически всех типов клеток, используемых для клеточной терапии: гематопоэтических и мезенхимальных клеток костного мозга, предшественников ЭК (циркулирующих и костно-мозговых), клеток, полученных из пуповинной крови и даже скелетных миобластов[14][15].

Альтернативой терапии рекомбинантными белками может быть генная терапия. Преобладают два типа векторных систем, которые применяются для доставки терапевтического гена в область ишемии: плазмиды и рекомбинантные аденовирусы[16].
В отличие от рекомбинантных белков генетические конструкции работают в ткани-мишени от одной до нескольких недель и обеспечивают менее резкое и более длительное повышение содержания ангиогенного фактора, что позволяет избежать частых и многократных инъекций, что, в свою очередь, позволяет избежать сенсибилизации организма[14]. В доклинических исследованиях на животных использование ДНК-плазмид продемонстрировало экспрессию генов продолжительностью от нескольких дней до нескольких месяцев с довольно низкой вероятностью дальнейшей передачи. Данный срок считается сравнительно коротким по сравнению с вирусными векторами, что является фактором безопасности препарата на основе плазмидного вектора. Плазмиды разрушаются внеклеточно, а также внутриклеточно нуклеазами, что обеспечивает локализацию и ограничение процесса во времени. Во время большого числа геннотерапевтических исследований для стимуляции ангиогенеза использовались преимущественно местные введения для достижения максимальной безопасности и эффективности[17].
Использование аденовирусных векторов отличается высокой эффективностью переноса генного материала. Но необходимо учесть, что в организме человека часто присутствуют аденовирусные антитела, снижающие эффективность передачи до уровня в 5 % — уровня, сравнимого тем, который характерен для невирусного переноса генов. Также вирусный перенос генов требует специальных мер биобезопасности, что не является необходимым для невирусных векторов — переносчиков генов. Вопросы безопасности также отражаются в повышенной частоте неблагоприятных явлений в клинических исследованиях с аденовирусными векторами: преходящая лихорадка, повышение С-реактивного белка, ферментов печени и титров аденовирусных антител[18].

Реализация информации, заключенной в плазмиде или рекомбинантном вирусе происходит в результате синтеза белка. Синтез протекает традиционным путём (транскрипция, трансляция). Образование ангиогенного фактора роста вызывает ряд физиологических изменений, приводящих к росту нового сосуда. В процессе ангиогенеза участвует большое число ангиогенных факторов, но наиболее активным проангиогенным цитокином является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который также является наиболее изученным как в доклинических, так и в клинических исследованиях.

Рисунок 2. Этапы ангиогенеза

Процесс роста сосудов с его участием можно описать в следующей последовательности[11]:

1. Связывание VEGF с рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток в существующих сосудах.
2. Активация эндотелиоцитов за счет из изменения конфигурации рецепторов VEGF.
3. Выделение активированными эндотелиальными клеткам протеолитических ферментов, которые растворяют базальную мембрану окружающую материнские сосуды.
4. Растворение матриксного вещества с помощью матриксных металлопротеаз.
5. Пролиферация и миграция эндотелиальных клеток через базальную мембрану в зону ишемии с использованием на клеточной поверхности молекул адгезии.
6. Связывание эндотелиоцитов друг с другом и образование трубчатых структур.
7. Образование сосудистых петель.
8. Дифференцировка сосудистых петель в артериальные и венозные сосуды.
9. Созревание новых кровеносных сосудов путём присоединения пристеночно других типов клеток (гладкомышечных, перицитов), и стабилизация сосудистой архитектуры.
10. Начало тока крови в зрелом стабильном сосуде.

Отсутствие сосудистого русла в помещаемых имплантатах, а также недостаточно быстрое его развитие и объединение с сетью сосудов рецепиентной области является одной из самых важных проблем, связанных с «отказом» имплантата «работать». Решение проблемы васкуляризации искусственных имплантатов развивается двумя путями: 1 – создание условий для активной васкуляризации после имплантации при помощи различных биоинженерных конструкций (использование факторов роста, стволовых клеток); 2 – создание сосудистой сети до имплантации в организм in vitro[19].

Геннотерапевтические препараты на основе плазмид, кодирующих факторы роста эндотелия сосудов, используются для ангиогенной модификации (витализации) синтетических волокнистых материалов[7]. Такие модифицированные ген-активированные материалы применяются для создания васкуляризированных матриксов биоинженерных органов и тканей[7][20].

При запросе публикаций в базе данных связанных с терапевтическим ангиогенезом и факторами роста получена статистика:

В клиническом изучении преобладают геннотерапевтические конструкции, несущие ген VEGF. В таблице № 2 отражены крупные проведенные и проводимые исследования с данными прототипами препаратов.

Таблица 2. Клинические исследования геннотерапевтических конструкций с геном VEGF

Аббревиатуры: ИБС — ишемическая болезнь сердца; ХИНК — хроническая ишемия нижних конечностей; КИНК — критическая ишемия нижних конечностей

Первый и единственный геннотерапевтический препарат для терапевтического ангиогенеза был зарегистрирован в России в 2011 году (дата РУ −28.09.2011 года). Препарат представляет собой плазмидную сверхскрученную Дезоксирибонуклеиновую кислоту pCMV-VEGF165, кодирующую человеческий фактор роста эндотелия сосудов. Показания для применения препарата: в комплексной терапии для реваскуляризации при ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза (IIa-III степени по А. В. Покровскому-Фонтейну).
На рынок препарат вышел под торговым наименованием «Неоваскулген». Он вводится местно, внутримышечно, максимально близко к ишемизированному участку и стимулирует развитие коллатерального кровообращения. [2, 38, 39]
По результатам клинических исследований российского препарата можно отметить следующие клинические особенности терапевтического ангиогенеза:

1. Применение препарата в комплексном консервативном лечении приводит к стойкому клиническому улучшению (сохранение эффекта в течение 3 мес., 6 мес., 1 года, 2 лет), которое выражается в увеличении дистанции безболевой ходьбы, увеличению показателя лодыжечно-плечевого индекса и транскутанного напряжения кислорода[17].
2. Показатель «количество больших ампутаций, смерть» у пациентов при III степени ишемии по классификации А. В. Покровского-Фонтейна равен 6 % [2].
3. Выраженный клинический эффект при различных степенях тяжести ишемии нижних конечностей по классификации А. В. Покровского-Фонтейна (IIа, IIб, III) [38].

Таблица 3. Результаты применения препарата на основе нуклеиновой кислоты («Неоваскулген»), кодирующей VEGF в комплексной консервативной терапии[17].

^*статистически значимые различия по сравнению с исходными показателями (p≤0,05, непараметрический метод критерий Вилкоксона).
При оценке динамики показателей с учетом исходной степени ишемии было установлено, что для всех групп пациентов (IIA, IIБ, III ст. ишемии) характерная стойкая положительная динамика. Так, дистанция безболевой ходьбы увеличивалась в большей степени при средней и тяжелой ишемии, о чём свидетельствовал прирост к 90 сут. на 160 % и 173 % при IIБ и III ст. ишемии соответственно. Весьма существенным представляется тот факт, что ЛПИ у самой тяжелой группы пациентов увеличился более чем на 0,1 с уровня 0,33±0,08 до 0,46±0,07 через 90 сут. и до 0,48±0,1 через год. Та же тенденция наблюдалась и по показателю TcPO2 — у более тяжелых пациентов отмечен более выраженный ответ на терапию (прирост 35,2 % через 90 сут. и 32,5 % через год).

Таблица 4. Результаты применения препарата на основе нуклеиновой кислоты («Неоваскулген»), кодирующей VEGF в комплексной консервативной терапии[21].

^*статистически значимые различия по сравнению с исходными показателями
^'статистически значимые различия между 90 сут. и 1 годом (p≤0,05, непараметрический метод критерий Вилкоксона).

1. Hockel M., Schlenger K., Doctrow S. at al. Therapeutic Angiogenesis. Arch Surg. 1993; 128: 423-9.
2. Швальб П. Г., Гавриленко А. В., Калинин Р. Е. и др. Эффективность и безопасность применения препарата «Неоваскулген» в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (IIb-III фаза клинических испытаний). КТТИ. 2011; 3: 76-83.
3. Мжаванадзе Н. Д., Бозо И. Я., Калинин Р. Е., Деев Р. В. Реалии и перспективы применения генной терапии в сердечно-сосудистой хиругии. КТТИ 2012; 2: 51-5.
4. Isner J., Walsh K., Symes J. et al. Arterial gene therapy for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease. Circulation. 1995; 91: 2687-92.
5. Isner J., Pieczek A., Schainfeld R., Blair R. et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischaemic limb. Lancet 1996 Aug 10;348(9024):370-4.
6. Baumgartner I., Rauh G., Pieczek A. et al. Lower-extremity edema associated with gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor. Ann Intern Med. 2000; 132(11):880-4.
7. Madeddu P. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration. Experimental physiology. 2004; 90: 315-26.
8. Mäkinen K. Angiogenesis — a new goal in peripheral artery occlusive disease therapy. Acta Chir Belg. 2003; 103: 470-4.
9. Malecki M., Kolsut P., Proczka R. Angiogenic and antiangiogenic gene therapy. Gene Therapy. 2005; 12: 159-69.
10. Li W., Li V. Angiogenesis in wound healing. Conteporary surgery. А supplement to соntemporary surgery. 2003; 36.
11. Azrin М. Angiogenesis, protein and gene delivery. British Medical Bulletin 2001; 59: 211-25.
12. Sylven С. Angiogenic gene therapy. Drugs of Today. 2002; 38: 819-27.
13. Парфенова Е. В., Ткачук В. А. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы. Кардиологический вестник. 2007; 2: 5-15.
14. Isner J., Vale P., Losordo D. and el. Angiogenesis and cardiovascular disease. Dialogues in сardiovascular medicine, 2001:3:145-70.
15. Григорян А.С., Шевченко К.Г. Возможные молекулярные механизмы функционирования плазмидных конструкций, содержащих ген VEGF. КТТИ 2011; 6(3): 24-8.
16. Деев Р. В., Червяков Ю. В., Калинин Р. Е. и др. Теоретические и практические аспекты применения препарата на основе нуклеиновой кислоты, кодирующей эндотелиальный сосудистый фактор роста («Неоваскулген»). Angiologia.ru. 2011; 1.
17. Meyer F., Finer M. Gene therapy: progress and challenges. Cell Moi Biol (Noisy-le-grand). 2001; 47: 1277-94.
18. Baumgartner I., Pieczek A., Manor O. et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation 1998; 97: 1114-23.
19. Symes J., Losordo D., Vale P. et al. Gene therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease. Ann Thorac Surg 1999; 68: 830-36.
20. Fortuin F., Vale P., Losordo D. et al. One-year follow-up of direct myocardial gene transfer of vascular endothelial growth factor-2 using naked plasmid deoxyribonucleic acid by way of thoracotomy in no-option patients. Am J Cardiol. 2003; 92: 436-9.
21. Reilly J., Grise M., Fortuin F. et al. Long-term (2-year) clinical events following transthoracic intramyocardial gene transfer of VEGF-2 in nooption patients. J Interv Cardiol. 2005; 18: 27-31.
22. Vale P., Losordo D., Milliken C. et al. Left ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF (165) gene transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia. Circulation 2000; 102: 965-74.
23. Sarkar N., Ruck A., Kallner G. et al. Effects of intramyocardial injection of phVEGF-A165 as sole therapy in patients with refractory coronary artery disease—12-month follow-up: angiogenic gene therapy. J Intern Med. 2001; 250: 373-81.
24. Losordo D., Vale P., Hendel R. et al. Phase 1/2 placebo-controlled, double-blind, dose-escalating trial of myocardial vascular endothelial growth factor 2 gene transfer by catheter delivery in patients with chronic myocardial ischemia. Circulation 2002; 105: 2012-18.
25. Gyongyosi M., Khorsand A., Zamini S. et al. NOGA guided analysis of regional myocardial perfusion abnormalities treated with intramyocardial injections of plasmid encoding vascular endothelial growth factor A-165 in patients with chronic myocardial ischemia: subanalysis of the EUROINJECT-ONE multicenter double-blind randomized study. Circulation 2005; 112 (Suppl): I157-I165.
26. Kastrup J., Jorgensen E., Ruck A. et al. Direct intramyocardial plasmid vascular endothelial growth factor-A165 gene therapy in patients with stable severe angina pectoris. A randomized double-blind placebo-controlled study: the Euroinject One Trial. J Am Coll Cardiol. 2005; 45: 982-8.
27. Stewart D., Kutryk M., Fitchett D. et al. VEGF gene therapy fails to improve perfusion of ischemic myocardium in patients with advanced coronary disease: results of the NORTHERN trial. Mol. Ther. 2009; 17: 1109-15.
28. Mendiz O., Favaloro L., Diez M. et al. Abstract 15235: high-dose plasmid VEGF gene transfer in patients with severe coronary artery disease: final results of the first Latin American trial of gene therapy in myocardial ischemia. Circulation 2011; 124 (Suppl.): A15235.
29. Kusumanto Y., van Weel V., Mulder N. et al. Treatment with intramuscular vascular endothelial growth factor gene compared with placebo for patients with diabetes mellitus and critical limb ischemia: a doubleblind randomized trial. Hum Gene Ther 2006; 17: 683-91.
30. Kukula K., Chojnowska L., Dabrowski M. et al. Intramyocardial plasmid-encoding human vascular endothelial growth factor A165/ basic fibroblast growth factor therapy using percutaneous transcatheter approach in patients with refractory coronary artery disease (VIF-CAD). Am Heart J 2011; 161: 581-9.
31. Makinen K., Manninen H., Hedman M. et al. Increased vascularity detected by digital subtraction angiography after VEGF gene transfer to human lower limb artery: a randomized, placebo-controlled, double-blinded phase II study. Mol Ther 2002; 6: 127-33.
32. Hedman M., Hartikainen J., Syvanne M. et al. Safety and feasibility of catheter-based local intracoronary vascular endothelial growth factor gene transfer in the prevention of postangioplasty and in-stent restenosis and in the treatment of chronic myocardial ischemia: phase II results of the Kuopio Angiogenesis Trial (KAT). Circulation 2003; 107: 2677-83.
33. Rajagopalan S., Mohler III E., Lederman R. et al. Regional angiogenesis with vascular endothelial growth factor (VEGF) in peripheral arterial disease: design of the RAVE trial. Am Heart J 2003; 145: 1114-18.
34. Rosengart T., Lee L., Patel S. et al. Angiogenesis gene therapy: phase I assessment of direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing VEGF121 cDNA to individuals with clinically significant severe coronary artery disease. Circulation 1999; 100: 468-74.
35. Stewart D., Hilton J., Arnold J. et al. Angiogenic gene therapy in patients with nonrevascularizable ischemic heart disease: a phase 2 randomized, controlled trial of AdVEGF (121) (AdVEGF121) versus maximum medical treatment. Gene Therapy 2006; 13: 1503-11.
36. Kastrup J., Jorgensen E., Fuchs S. et al. A randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre study of the safety and efficacy of BIOBYPASS (AdGVVEGF121.10NH) gene therapy in patients with refractory advanced coronary artery disease: the NOVA trial. EuroIntervention 2011; 6: 813-18.
37. Ropper A., Gorson K., Gooch C. et al. Vascular endothelial growth factor gene transfer for diabetic polyneuropathy: a randomized, double-blinded trial. Ann Neurol 2009; 65: 386-93.
38. Деев Р. В., Калинин Р. Е., Червяков Ю. В. и др. Результаты применения гентерапевтического препарата «Неоваскулген» у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей: 1 год наблюдений. Вестник национального медико-хирургического центра им. Н. И. Пирогова. 2011; 4: 20-5.
39. Швальб П. Г., Калинин Р. Е., Грязнов С. В. и др.. Безопасность и краткосрочная эффективность генотерапевтичесого препарата у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. 2011; 4: 61-6.