МТТ-тест
MTT-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Другие близкородственные тетразолиевые красители: XTT, MTS и WST, которые используются в связи с промежуточным электроноакцептором, 1-метокси-феназин-метосульфатом (PMS). С WST-1, который не проникает в клетки, восстановление происходит вне клетки посредством транспорта электронов через клеточную оболочку.[1] Тетразолиевые красители могут также быть использованы для измерения цитотоксичности (потери живых клеток) или цитостатической активности (сдвиг от пролиферации к состоянию покоя) потенциальных лекарственных агентов и токсичных веществ. MTT-тесты обычно выполняются в темноте, так как реагенты MTT чувствительны к свету.
MTT и связанные тетразолиевые соли
MTT — жёлтый тетразол, восстанавливается в пурпурный формазан в живых клетках.[2] Растворяющий компонент (обычно либо диметилсульфоксида, кислотный раствор этанола или раствор детергента лаурилсульфата натрия (SLS) или додецилсульфат натрия (SDS) в разбавленной соляной кислоте) добавляется, чтобы перевести нерастворимый пурпурный формазан в цветной раствор. Коэффициент поглощения этого цветного раствора может быть выражен количественно путём измерения при определенной длине волны (обычно между 500 и 600 нм) методом спектрофотометрии. Степень поглощения света зависит от растворителя.
XTT (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолиум-5-карбоксанилид) был предложен в качестве замены MTT, давая бо́льшую чувствительность и более высокий динамический диапазон. Образующийся формазановый краситель растворим в воде, это позволяет избежать последнюю стадию растворения.[3]
Растворимые в воде соли тетразолиума — более поздние альтернативы MTT: они были разработаны путём введения позитивного или негативного заряда и гидроксильных групп в бензольное кольцо тетразолиевой соли или, ещё лучше, сульфонатных групп, которые добавляют бензольное кольцо прямо или опосредованно.
MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолиум), в присутствии феназина метосульфата (англ. PMS) производит формазановый продукт с максимумом поглощения при 490—500 нм в фосфатном буферном солевом растворе. MTS-тест часто описывается как 'одноступенчатый' MTT-тест, в котором удобно добавлять реагент непосредственно в культуру клеток без периодичных стадий в тесте MTT. Однако это удобство делает MTS-тест чувствительным к помехам в колориметрическом анализе, так как периодические стадии в MTT-тесте позволяют удалить следы окрашенных веществ, в то время как они остаются на микротитрационном планшете в одноступенчатом тесте MTS. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы убедиться в аккуратности использования этого метод. Это достаточно важные аргументы для подтверждения результатов MTS, используя качественное наблюдение под микроскопом. (Это замечание, однако, релевантно для всех колориметрических тестов.)[4]
WSTs (англ. Water-soluble Tetrazolium salts, Водорастворимые тетразолиевые соли) — группа других водорастворимых красителей для теста МТТ, разработанная с тем, чтобы давать другие спектры поглощения получаемых формазанов.[5] WST-1 и особенно WST-8 (2-(2-метокси-4-нитропентил)-3-(4-нитропентил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолиум) имеют преимущества перед МТТ в том, что они восстанавливаются вне клеток, соединяются с медиатором электронов PMS и формируют водорастворимый формазан. Наконец, WST-тесты (1) могут быть прочитаны сразу же (в отличие от MTT-тестов, которые требуют стадию растворения), (2) дают более эффективный сигнал, чем MTT, и (3) уменьшают токсичность для клеток (в отличие от проницаемого для клеток MTT, и его нерастворимого формазана, который накапливается внутри клеток).[5]
Значение МТТ-теста
Восстановление тетразолиевого красителя зависит от НАДФ-H-зависимых оксидоредуктазных ферментов большей частью в цитозоли клетки.[6][7] Поэтому восстановление МТТ и других тетразолиевых красителей зависит от клеточной метаболической активности из-за тока НАДФ-H. Клетки с низким уровнем метаболизма, как, например, тимоциты (клетки вилочковой железы) и селезёночные макрофаги восстанавливают очень мало MTT. Напротив, быстро делящиеся клетки показывают высокую степень восстановления MTT. Важно помнить, что условия проведения теста могут изменять метаболическую активность и таким образом восстановление тетразолиевых красителей без влияния на жизнеспособность клетки. Кроме того, механизм восстановления тетразолиевых красителей, то есть внутриклеточный (MTT, MTS) по сравнению с внеклеточным (WST-1), также определяет количество продукта.
При заселении исследуемыми клетками пористых материалов на результаты МТТ-теста может оказывать влияние толщина таких материалов.[8]
Ссылки
- Berridge MV, Herst PM , and Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127—152 (2005)
- Mosmann, Tim. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays (англ.) // Journal of Immunological Methods : journal. — 1983. — December (vol. 65, no. 1—2). — P. 55—63. — ISSN 0022-1759. — doi:10.1016/0022-1759(83)90303-4. — PMID 6606682.
- Why should I use XTT instead of MTT (PDF, 0.1 MB). aniara.com. ANIARA. Дата обращения: 19 ноября 2010.
- Cory A. H., Owen T. C., Barltrop J. A., Cory J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture (англ.) // Cancer communications : journal. — 1991. — July (vol. 3, no. 7). — P. 207—212. — ISSN 0955-3541. — PMID 1867954.
- Water Soluble Tetrazolium Salts (WSTs) (PDF, 0.4 MB). interchim.com. Interchim. Дата обращения: 12 августа 2013.
- Berridge MV, Herst PM , and Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127—152 (2005).
- Berridge MV, Tan AS. Characterisation of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): Subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives Biochem Biophys 303:474-482 (1993).
- T.S. Rasulov, M.E. Krasheninnikov, A.G. Demchenko, O.A. Krasilnikova, S.P. Boev, et al. POSSIBILITIES OF THE MTT ASSAY MODIFICATION FOR ASSESSMENT OF CYTOCOMPATIBILITY OF 3D CELL-SEEDED MICROFIBER SYNTHETIC SCAFFOLDS // Современные проблемы науки и образования (Modern Problems of Science and Education). — 2020. — Вып. №3. — С. 74–74. — doi:10.17513/spno.29834.
Литература
- Wilson, Anne P. Chapter 7: Cytotoxicity and viability // Animal Cell Culture: A Practical Approach (рум.) / Masters, John R. W.. — 3rd. — Oxford: Oxford University Press, 2000. — Т. Vol. 1. — ISBN 978-0-19-963796-6.
- Bernas T., Dobrucki J. Mitochondrial and nonmitochondrial reduction of MTT: interaction of MTT with TMRE, JC-1, and NAO mitochondrial fluorescent probes (англ.) // Cytometry : journal. — 2002. — April (vol. 47, no. 4). — P. 236—242. — ISSN 1552-4922. — doi:10.1002/cyto.10080. — PMID 11933013.