Слейтер, Эдвард Чарльз

После окончания Мельнбурнского университета работал в Канберрском анатомическом институте над определением содержания витаминов в продуктах питания. Витамин B1 (тиамин) определял тиохромным методом, который был разработан Барендом Конрадом Петрусом Янсеном. Во время Второй мировой войны изучал и синтезировал БАЛ (британский антилюизит), представлявший собой смесь дитиола и димеркаптопропанола, эта работа повлияла на его дальнейшие исследования. Когда риски использования химического оружия снизились, Слейтер вернулся в Канберру, где продолжил исследования питательных веществ. Изначально работа состояла в определении содержания витаминов в рационе солдатских пайков, как говорил в интервью 1992 года сам Слейтер, это была «глупая и совершенно бесполезная работа». Однако он с удовольствием описывает эксперимент, в котором сам был в роли подопытной мыши. Слейтер полагал, что сульфонамиды, щедро раздаваемые солдатам для борьбы с инфекциями, мешают усвоению тиамина. Чтобы это проверить, он, хоть и без удовольствия, но ел солдатские пайки, параллельно принимая сульфонамид. Результат эксперимента был положительный: употребление сульфонамидов существенно увеличивало выведение тиамина из организма. После войны эти результаты были опубликованы в Nature[2]. Позже Слейтер и Кратцинг, проводя эксперименты над крысами, обнаружили, что сульфонамиды подавляли работу щитовидной железы[3]. Из-за замедления обмена веществ снижалась потребность в тиамине, что приводило к выведению излишков из организма. Слейтер пишет: «хотя результаты этих протяженных во времени экспериментов не имели или почти не имели значения, но я никогда не писал столь удовлетворительной для себя работы, когда в столь сжатых условиях я полностью разрешил проблему, используя себя самого в качестве подопытного животного»[4].

В лаборатории Девида Кейлина первым проектом Слейтера было изучение ингибирования реакции окисления сукцината сукцинатдегидрогеназой при помощи дисульфида глутатиона. Изучая эту реакцию, он использовал препараты, полученные Кейлином и Хартри из сердечных мышц (теперь известно, что препарат содержал фрагменты внутренней митохондриальной мембраны). Слейтер обнаружил, что глутатион значительно сильнее ингибирует окисление сукцината, а БАЛ ингибирует реакцию еще сильнее. Так Слейтер пришел к своему первому открытию – БАЛ ингибирует не саму сукцинатдегидрогеназу, а окисление сукцината в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). Блокировался неизвестный компонент ЭТЦ, долгое время известный впоследствии как «фактор Слейтера». После первой своей публикации на тему фактора Слейтера[5] он следующие два года тщательно изучает окисление сукцината и НАДН в ЭТЦ, а также проводит дополнительные эксперименты для подтверждения того факта, что был открыт новый компонент ЭТЦ и исключения любой возможности, что БАЛ-зависимость фактора – случайность. Его работы за этот период публикуются в серии статей в журнале Biochemical Journal[6][7][8][9][10], с тех пор Слейтер – признанный эксперт по ЭТЦ. Но в концепции электрон-транспортной цепи Слейтера того времени все еще не хватало нескольких компонентов. Наиболее досадным упущением для него было игнорирование цитохрома c₁, так как он просто не верил доказательствам его существования[11].

В 1949 Слейтер приезжает в Нью-Йорк, где в Рокфеллеровском университете приступает к изучению окислительного фосфорилирования в лаборатории председателя фармакологического подразделения Нью-Йоркского университета Северо Очоа. Российский ученый Владимир Энгельгардт ранее открыл реакцию окислительного фосфорилирования[12], а Ленинджер затем доказал, что этот процесс катализируется выделенными митохондриями. Слейтер продолжил эксперименты Очоа с препаратами гомогенизированных крысиных сердец для изучения окислительного фосфорилирования.

Став членом Агрокультурного исследовательского совета (ARC), Слейтер продолжил работу в лаборатории Кейлина на независимой должности. В соавторстве с Уолтером Боннером Слейтер опубликовал подробное исследование ингибирования сукцинатдегидрогеназы фосфофторорганическими соединениями, в ней они описали улучшенную методику измерения ферментативной активности[13]. В сотрудничестве с Клиландом Слейтер разработал методику выделения стабильных митохондрий из клеток сердечной мышцы, что стало возможным благодаря добавлению ЭДТА в изолирующую среду. ЭДТА связывало ионы Ca²⁺, которые в противном случае были бы поглощены митохондрией[14]. Использование стабильных митохондрий позволило Слейтеру и Холтону точно измерить отношение фосфат/кислород (P/O ratio) в реакции окисления 2-оксоглутарата митохондрией сердца. Полученное значение, равное трем, отличалось от значений в других исследованиях[15]. Работая со Стэном Льюисом, Слейтер изучал митохондрии мясных мух и доказал, что эти митохондрии способны катализировать реакцию окислительного фосфорилирования[16], в то время как более ранние работы других ученых сообщали об обратном. Эта работа натолкнула Слейтера на предположение о механизме окислительного фосфорилирования, который в дальнейшем будет называться химической гипотезой. Он предложил следующие уравнения реакций:

${\displaystyle {\ce {AH2 + B + C <-> A-C + BH2}}}$

${\displaystyle {\ce {A-C + Pi + ADP <-> A + C + ATP}}}$

AH₂ и B – сопряженные звенья в ЭТЦ, С участвует в окислительно-восстановительной реакции и остается ковалентно связанным с А в виде высокоэнергетического соединения, которое далее участвует в синтезе АТФ. Это соединение A–C гидролизуется динитрофенолом, что и использовал Слейтер для отделения реакций в ЭТЦ от связанного с ними фосфорилирования. Статья в журнале Nature, в которой Слейтер описал свою гипотезу, стала самой известной его статьей, а на этой гипотезе основана большая часть его последующих исследований[17].

В Амстердаме Слейтер продолжил свои исследования механизма реакции окислительного фосфорилирования. Поначалу у него не было подходящего оборудования для проведения сложных экспериментов, поэтому он выбрал объектом исследований митохондриальную АТФазу, активность которой было легко измерить. Первые эксперименты в Амстердаме проводились исходя из предположения, что во внутренней митохондриальной мембране существует три вида АТФаз, но оно не было экспериментально подтверждено[18]. Однако, эксперименты Слейтера показали, что ингибиторы из ЭТЦ не влияют на активность АТФазы, и в гипотезу Слейтера о механизме окислительного фосфорилирования следует включить еще одно промежуточное соединение:

${\displaystyle {\ce {AH2 + B + I <-> A-I + BH2}}}$

${\displaystyle {\ce {A - I + X <-> A + X - I}}}$

${\displaystyle {\ce {X - I + ADP + Pi <-> X + I + ATP}}}$

Обозначенный интермедиат X–I чувствителен к веществам, прерывающим последовательность реакций окислительного фосфорилирования. Определение соединений A–I и X–I, необходимых для точного установления механизма реакции, будет являться основной темой исследований Слейтера. Начало положила работа постдока Джека Первиса (1958)[19], в которой были найдены признаки, что A–I существует в виде НАД–I. Затем в своей работе Кэрел Ван Дам 1964 года доказал, что обнаружение НАД–I было ошибкой эксперимента[20]. В то же время шла дискуссия между Слейтером и Митчеллом. Несколько ранее студенты Слейтера выяснили, что фосфорилирование сопряжено с конкретными этапами работы ЭТЦ. Не получившая должного внимания работа Коэна Хемкера 1962 года[21], в которой он опирался на результаты Слейтера, показала влияние pK и растворимости липидов на прерывание реакции соединениями гомологического ряда 2,6-динитро-4-алкилфенолов. Он пришел к выводу, что прерывающая активность определялась содержанием в митохондриальной мембране фенола, предполагая, что фенолы тормозят реакцию благодаря их способности к челночному переносу протонов через мембрану. Этот вывод согласовался с хемиосмотической теорией Митчелла, но шел вразрез с предположениями Слейтера.

В сотрудничестве с профессором педиатрии ван Кревельдом, открывшим ранее первую болезнь накопления гликогена, участвовал в проекте по изучению дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G-6-PD) и болезням, связанным с накоплением гликогена[22].