Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом. Смеси маркерных белков доступны в различном интервале масс. Калибрование предполагает построения зависимости относительной электрофоретической подвижности (Rf) каждого из маркерных белков от десятичного логарифма их молекулярной массы. Обычно зависимость имеет вид сигмообразной кривой. Расчет молекулярной массы исследуемого белка осуществляют относительно его Rf, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются в случае, если длина пробега белков-маркеров составляет не менее 80 % длины разделяющего геля, а зависимость их Rf от логарифма молекулярной массы является линейной (R²> 0,95). То есть для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает электрофоретическую подвижность исследуемого белка.

Чувствительность метода SDS-PAGE по Лэммли обратно пропорциональна молекулярной массе белка. Например, в интервале 10-20 кДа удается разделить белки, отличающиеся всего на 0,1 кДа (разница всего в один аминокислотный остаток). Однако для получения удовлетворительных результатов следует выполнить несколько простых методических рекомендаций. Так, в связи с тем, что высокая электропроводность исследуемых образцов способна значительно исказить электрофоретическую подвижность белка, их ионная сила должна быть по возможности минимальной и приблизительно равной. Еще одним важным условием надежности определения молекулярной массы является оптимальная нагрузка белка на гель. При окраске Coomassie Blue R250 оптимальное содержание белка в пятне должно находиться в пределах 0,1-1 мкг и как минимум на порядок меньше при окраске серебром. В противном случае белки в геле сформируют широкие пятна, что затруднит определение их электрофоретической подвижности. Несмотря на высокую чувствительность и несложность метода молекулярная масса белков, определенная с использованием SDS-PAGE, часто отличается от истинного значения. Разница может составлять от нескольких кДа для низкомолекулярных белков до десятков кДа для высокомолекулярных белков.

Метод SDS-PAGE незаменим в случае необходимости количественного определения индивидуального белка в сложном не только по белковому составу образце. Примером такого образца могут быть грубые экстракты или лизаты клеток. При этом метод пригоден для исследования как нативных белков, так и белков, изменивших свою структуру. Такими белками могут быть полимеры, агрегаты или полностью денатурированные молекулы. Относительная нетребовательность метода к составу образца и структурному состоянию в нем белков выгодно отличают SDS-PAGE от других методов количественного определения, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии или иммуноферментного анализа.

Количественное определение белка с помощью SDS-PAGE предполагает необходимость калибровки геля относительно зависимости интенсивности окраски белкового пятна в геле от количества белка в этом пятне. Для этого в геле параллельно с исследуемыми образцами разделяют несколько образцов сравнения с точно известным разным количеством эталонного белка. После визуализации белков в геле с помощью денситометра проводят измерение плотности каждого белкового пятна образцов сравнения. Определяют зависимость этой плотности от количества белка. Калиброванный гель используют для расчета количества исследуемого белка относительно плотности его пятна, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются в случае, если зависимость плотности белковых пятен для эталонного белка от количества белка в пятне является линейной (R²> 0,95). То есть для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает плотность пятна исследуемого белка. При этом следует отметить, что подбор оптимальной концентрации белка в исследуемом образце осуществляют эмпирически.

При количественном определении белков с помощью SDS-PAGE следует учитывать одну существенную особенность этого метода. Так, в связи с тем, что эффективность окраски белка в геле зависит от его природы, например, аминокислотного состава, молекулярной массы, наличия простетических групп, эталонный белок, используемый для калибровки геле, и исследуемый белок должны быть идентичными. В случае отступления от этого правила разница между истинным и полученным количеством может отличаться в несколько раз.

Метод SDS-PAGE по Лэммли позволяет количественно определить содержание только тех примесей, которые отличаются своей молекулярной массой от молекулярной массы исследуемого белка. Для этого в одном геле разделяют исследуемый образец параллельно с одним или несколькими образцами сравнения, количество эталонного белка в которых сравнимо с ожидаемым количеством примесей в растворе исследуемого белка. Например, если концентрация белка в исследуемом образце составляет 1 мг/мл, а ожидаемое количество примесей в нем находиться в пределах 1 %, то в качестве образца сравнения используют минимум один раствор эталонного белка с концентрацией 10 мкг/мл. После визуализации белков в геле с помощью денситометра проводят измерение плотности каждого белкового пятна для исследуемого образца и образца сравнения.

Метод SDS-PAGE пригоден для определения димеров и полимеров белка, накапливающихся за счет спонтанного замыкания межмолекулярных дисульфидных связей, например, во время ненадлежащего хранения препарата. Для этого исследуемый белок и белок сравнения разделяют в геле в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Примеси являются димерами и полимерами в том случае, если они выявляются в восстанавливающих и не выявляются в невосстанавливающих условиях. При этом их молекулярная масса должна быть кратна молекулярной массе испытуемого белка. Таким образом, оценка чистоты белкового препарата методом SDS-PAGE в восстанавливающих условиях позволяет определить только негомологичные белковые примеси.

Результаты определения чистоты образца могут быть как полуколичественными, так и количественными. В том случае, если сравнение плотности пятен примесных белков проводят относительно одного пятна эталонного белка, полученный результат является полуколичественным. Его формулировка может звучать, например, следующим образом: «Содержание белковых примесей в исследуемом растворе не превышает 1 %». Количественное определение белковых примесей проводят согласно рекомендациям к количественному определения белков методом SDS-PAGE.

В дополнение к описанным подходам в некоторых лабораториях практикуется способ определения гомогенности препарата без использования образцов сравнения. В таком случае чистота исследуемого белка определяется по плотности пятна в геле, которое оценивается в процентах от суммы плотностей всех выявленных белковых пятен. Такой подход не отражает истинное количество примесей, однако может служить качественной оценкой чистоты препарата. Метод нельзя отнести к количественным в связи с тем, что число и плотность выявленных белковых пятен прямо пропорционально количеству общего белка в испытуемом образце и чувствительности метода определения белков в геле. К том же, зависимость плотности белкового пятна от количества в нем белка в диапазоне, превышающем один порядок, часто не линейна.