Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением

Первый этап SELEX — это создание большой библиотеки олигонуклеотидов с фиксированной длиной, но полностью или частично случайными последовательностями. Однако области с вариабельной последовательностью должны быть фланкированы участками с жёстко фиксированной последовательностью, чтобы была возможна их амплификация с помощью ПЦР. Олигонуклеотиды изначально получают путём химического синтеза, а затем амплифицируют с помощью ПЦР так, чтобы каждая случайная последовательность присутствовала в библиотеке во множестве копий. В случае РНК-аптамеров проводят in vitro транскрипцию случайных последовательностей. Высокая копийность каждой случайной последовательности снижает вероятность того, что потенциальный сайт связывания будет утерян в силу стохастических причин. Чтобы олигонуклеотиды смогли приобрести нативную пространственную структуру, их переводят в одноцепочечный вид и лишь после этого инкубируют с лигандом-мишенью[2][3][10].

Непосредственно перед добавлением олигонуклеотидов к лиганду библиотеку одноцепочечных олигонуклеотидов нагревают и медленно охлаждают, чтобы они приобрели термодинамически устойчивую вторичную и третичную структуру[3][7]. Далее библиотеку случайных последовательностей (рандомизированную библиотеку) инкубируют вместе с иммобилизированным лигандом-мишенью, чтобы дать возможность аптамерам связаться с ним. Протоколы инкубации библиотеки с лигандом могут различаться, в частности, могут использоваться различные походы для иммобилизации лигандов, отделения несвязавшихся олигонуклеотидов, различные время и температура инкубации, буферы, в которых происходит инкубация, а также соотношения концентраций олигонуклеотидов и лигандов. Лиганды иммобилизуют на колонках для аффинной хроматографии[3], нитроцеллюлозных фильтрах[2] или магнитных шариках[7]. Была также разработана разновидность SELEX, в которой в качестве лиганда выступает целая клетка. В этом случае инкубация библиотеки олигонуклеотидов происходит непосредственно в культуральных чашках, в которых растут клетки[11]. Состав буфера, в котором происходит инкубация, зависит от свойств лиганда и требований к аптамерам, успешно прошедшим отбор. Например, если лигандом являются отрицательно заряженные малые молекулы или белки, используются буферы с высокой концентрацией солей, способствующие связыванию аптамера с лигандом. Если же требуется получить аптамер, связывающийся с белком в условиях in vivo или с целой клеткой, который планируется использовать в диагностических или терапевтических целях, то для инкубации используют буферы, по концентрациям солей близкие к плазме крови, а сам процесс проводят при физиологических температурах, чтобы отобранные аптамеры наиболее вероятно связывались с лигандом именно in vivo. Буферы для инкубации также могут содержать неспецифичные вещества-компетиторы. Если есть высокая вероятность того, что олигонуклеотиды, не связывающиеся с лигандом, будут, тем не менее, оставаться в реакционной смеси за счёт неспецифичного связывания с матрицей, то неспецифичные компетиторы (малые молекулы или полимеры, по свойствам близкие к олигонуклеотидам библиотеки) будут препятствовать неспецифическому удержанию неподходящих аптамеров в реакционной смеси[11]. Свойства отобранных аптамеров могут также зависеть от соотношения концентраций лиганда и олигонуклеотидов. Если перед исследователем не стоит задачи получить аптамеры с очень сильным сродством к лиганду, то стоит использовать избыток лиганда, чтобы увеличить вероятность того, что хотя бы какие-то олигонуклеотиды смогут с ним связаться. Однако, если, напротив, необходим высокоспецифичный аптамер, сильно связывающий лиганд, то в избытке нужно брать олигонуклеотиды. Так будут созданы конкуренция между аптамерами и условия для отбора наиболее подходящих из них[2].

После того, как библиотека олигонуклеотидов была проинкубирована вместе с лигандом достаточное время, несвязавшиеся олигонуклеотиды вымывают, а связавшиеся при этом остаются связанными с иммобилизованным лигандом[3]. Когда несвязавшиеся последовательности удалены, необходимо элюировать связавшиеся аптамеры, разрушив его связь с иммобилизованным лигандом. Для элюции создают денатурирующие условия, при которых аптамеры теряют свою пространственную структуру, лишаются связей с лигандом и вымываются деионизированной водой[3]. Денатурирующие условия создаются за счёт растворов, содержащих мочевину или ЭДТА[11][12], а также под действием высокой температуры или физического воздействия. После элюции высвободившиеся олигонуклеотиды подвергаются обратной транскрипции, если они являются РНК или необходимо введение модифицированных нуклеотидов[2][3][11], а ДНК-нуклеотиды просто собираются для дальнейшей амплификации[13]. Полученные фрагменты ДНК далее амплифицируются с помощью ПЦР и переводятся в одноцепочечную ДНК (оцДНК), РНК или олигонуклеотид с модифицированными основаниями, которые будут использованы для следующего цикла отбора[2][3].

Следующий этап SELEX — получение оцДНК, которая будет использована для дальнейшей амплификации с помощью ПЦР. Один из наиболее простых способов получения оцДНК — использование для ПЦР биотинилированных реверсных праймеров, благодаря чему синтезированные комплементарные цепи ДНК будут нести биотин. С помощью биотина их можно закрепить к смоле, а вторую цепь дуплекса элюировать раствором щёлочи. Другой метод для получения оцДНК — асимметричная ПЦР, при которой прямой праймер берётся в избытке, а обратный праймер — в очень небольшом количестве, благодаря чему синтезируется больше одноцепочечных фрагментов. Недостаток асимметричной ПЦР заключается в том, что после ПЦР одноцепочечный продукт необходимо очистить от двуцепочечной ДНК и других лишних фрагментов. Ненужные цепи можно разрушить ферментативно, предварительно пометив их так, чтобы её распознавала, к примеру, лямбда-экзонуклеаза. Ферменты разрушат ненужную цепь, а целевая оцДНК останется нетронутой[2][3].

Для повышения специфичности аптамеров, отобранных с помощью SELEX, непосредственно до инкубации или сразу после неё можно ввести дополнительный этап — отрицательный отбор. Этот этап нужен для удаления из смеси последовательностей, которые связываются не с лигандом, а с матрицей, на которой он иммобилизован[12][14][13]. Отрицательный отбор заключается в добавлении в смесь аналогов лиганда, неспецифичных белков и других молекул, которые собирают на себя все неспецифичные олигонуклеотиды[11][13][15].

Чтобы следить за ходом SELEX, можно сравнивать количество молекул лиганда, провзаимодействовавших с аптамерами, которое связано с числом элюированных олигонуклеотидов, с общим количеством олигонуклеотидов, которые теоретически элюируются на каждом этапе. Количество элюированных олигонуклеотидов оценивают, измеряя поглощение при длине волны 260 нм, или с использованием флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов. Когда процесс SELEX подходит к концу, доля олигонуклеотидов, связывающихся с аптамером, доходит до 100 %, и число элюированных олигонуклеотидов становится равным (или несколько меньшим) размеру использовавшейся в инкубации библиотеки[3][16].