Саузерн-блот

Са́узерн-блот[1], Са́узерн-бло́ттинг[2], бло́ттинг по Са́узерну[2], блот Са́зерна[3], бло́ттинг Са́зерна[3], са́зерн-блот[4], са́зерн-бло́ттинг[3] (от англ. Southern blot) — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Он заключается в переносе разделённых электрофорезом в агарозном геле фрагментов ДНК на мембранный фильтр и последующем обнаружении в них известной последовательности из ДНК-зонда с помощью гибридизации с ним. Метод называется по имени изобретателя, английского биолога Эдвина Саузерна[5].

Саузерн-блоттинг

Другие технологии переноса c помощью промакивания (блота, блоттинга), например вестерн-блот, нозерн-блот, саузвестерн-блот, используют сходные методы, но для определения РНК или белка в образце, и называются по образцу метода, придуманного Саузерном.

Метод
  1. Рестрикция эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.
  2. Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.
  3. Если присутствуют фрагменты ДНК длиннее 15 тыс. п. н., перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой. Это вызывает депуринизацию фрагментов ДНК, разбивая их на меньшие части, что облегчает последующий перенос на мембрану.
  4. В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.
  5. Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким потенциалом влаги в зону с низким потенциалом влаги (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.
  6. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в обычной или вакуумной печи до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).
  7. Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченного ДНК-зонда, обладающего заранее известной последовательностью ДНК, с мембраной.
  8. После гибридизации, излишки ДНК-зонда отмывают с мембраны и картина гибридизации визуализируется на рентгеновской пленке путём авторадиографии (в случае радиоактивного зонда) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).

Результаты

Гибридизация зонда со специфическим фрагментом ДНК на мембране фильтра указывает на то, что этот фрагмент содержит последовательность ДНК, комплементарную последовательности нуклеотидов зонда.

Применение

Саузерн-блоттинг, который проводят с геномной ДНК, обработанной эндонуклеазами рестрикции, может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Зонд, который гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что зонд гибридизовался с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.

Примечания
  1. Заяц Р. Г., Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В., Рачковская И. В.. 7.2.2 Анализ фрагментов ДНК // Медицинская биология и общая генетика : учебник. — 2-е изд., испр. — Минск : Вышэйная школа, 2012. — С. 100. — 496 с. — ISBN 978-985-06-2182-5.
  2. Арефьев В. А., Лисовенко Л. А.. Southern-blotting, Southern-transfer // Англо-русский толковый словарь генетических терминов / науч. ред. Л. И. Патрушев. — М., 1995. — ISBN 5-85382-132-6.
  3. блот Сазерна // Большой энциклопедический словарь медицинских терминов / под ред. проф. Э. Г. Улумбекова. — М. : ГЭОТАР-Медиа, 2012. — С. 220. — 2263 с. — 2000 экз. — ISBN 978-5-9704-2010-2.
  4. Блот: вестерн-, нозерн- и сазерн-блот (blot, western, northern, southern) // Эпидемиологический словарь / под ред. Дж. М. Ласта для Международной эпидемиологической ассоциации; отв. ред. русского изд. В. В. Власов. — 4-е изд. — М. : ОИЗ, 2009. — С. 28, 272. — 316 с.
  5. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J Mol Biol.. — 1975. — doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.

См. также
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.