Рецептор ГАМК_A

Схема строения субъединицы ГАМК_A-рецептора.
Слева — топология субъединицы. Большой внеклеточный N-концевой домен несёт характеристический цистеиновый мостик (Cys-Cys), который присутствует во всех пентамерных ионных каналах, и места связывания агонистов и модуляторов. Трансмембранные домены показаны в виде цилиндров (1-4) с доменом ТМ2, выстилающим ионный канал (оранжевый). Крупнейшая внутриклеточная петля (между доменами ТМ3 и ТМ4) несёт места связывания многочисленных внутриклеточных модуляторов и сегменты, участвующие в стабилизации и фиксации рецептора в клеточной мембране. В процентах показаны относительные пропорции молекулы субъединицы рецептора, которые находятся по разные стороны плазматической мембраны и внутри неё.
Справа — четвертичная структура рецептора. Пентамерный комплекс субъединиц формирует нативный ГАМКА-рецептор, при этом домены ТМ2 каждой субъединицы расположены так, что формируют ионный канал, по которому проходят анионы Cl^- и НСО₃^- после активации рецептора агонистом (ГАМК).

Ионотропные ГАМК_А-рецепторы впервые были выделены из бычьего мозга в 1987 году, и их структура тогда была определена как состоящая из двух субъединиц. Но позже, благодаря методикам молекулярного клонирования было выделено большое количество разных субъединиц, которые могут входить в состав этого рецептора. Перечень субъединиц включает семь различных семей, многие из которых насчитывают более чем один вид белка. Это семьи, α (6 изоформ), β (три изоформы), γ (три изоформы), а также δ, ε, π и θ (одна изоформа в каждой). Гомология (сходство) в последовательностях аминокислот между изоформами одной семьи достигает по меньшей мере 70 %, в то время как между представителями разных семей — меньше чем 40 %; подробнее о свойствах рецепторов, которые образуются различными комбинациями субъединиц, см. в таблице 1.

Каждый функционирующий ГАМК_А-рецептор представляет собой гетеропентамер, где все пять субъединиц имеют одинаковую третичную структуру. Эта структура состоит в наличии большого N-терминального домена, характеристическим признаком которого для этого типа рецепторов является дисульфидный мостик между двумя остатками цистеина (так называемая «cys-cys-петля») — черта, присущая всем ионно-канальным рецепторам. Также на N-терминальном домене находятся многочисленные места связывания различных лигандов и участок, который активирует рецептор при связывании с ним молекул ГАМК.

За N-терминальным доменом идут четыре трансмембранных домена (ТМ1-4), среди которых ТМ2 вводит внутреннюю выстилку просвета ионного канала. Между доменами ТМ3 и ТМ4 находится большой внутриклеточный регион, который содержит сегменты, применяемые для фосфорилирования с помощью протеин-киназ, а также места присоединения многочисленных фиксирующих и проводящих протеинов. За доменом ТМ4 расположен очень короткий С-терминал. В целом, количество аминокислотных остатков, которые составляют третичную структуру одной субъединицы, равно примерно 400.

Большое количество типов субъединиц ГАМК_А-рецептора (всего 16) приводит к большому количеству структурно отличных ГАМК_А-рецепторов, которые могут быть теоретически ими сформированы. Но практически in vivo уровень многообразия функциональных ГАМК_А-рецепторов является намного меньшим. Благодаря комплексным молекулярно-биологическим исследованиям было установлено, какие именно комбинации субъединиц могут формировать функциональные ГАМК_А-рецепторы — см. Таблицу 1. При этом надо заметить, что не все искусственно синтезированные нормально функционирующие формы рецепторов, приведенные в таблице, в настоящее время найдены в мозге.

Исследования рекомбинантных ГАМК_А-рецепторов показали, что функциональные свойства ГАМК_А-рецепторов во многом определяются составом субъединиц рецептора. В целом, доказанными могут считаться следующие закономерности:

• Отсутствие β-субъединицы в составе рецептора заметно уменьшает или даже полностью блокирует чувствительность к ГАМК;
• Создание комбинаций α-β увеличивает чувствительность к ГАМК, но полученные таким образом каналы имеют относительно низкую проводимость (12-18 pS). Также эти рецепторы нечувствительны к бенздиазепинам и могут быть ингибированы с помощью низких концентраций Zn²⁺ (~100-200 нМ);
• Привлечение γ-субъединицы, что приводит к формированию комбинаций α-β-γ, незначительно снижает чувствительность ГАМК сравнению с α-β-рецепторами; также таким рецепторам присуща аллостерическая модуляция бенздиазепинами и заметно меньшая чувствительность к ионам Zn²⁺ (Около 200—500 μМ). Проводимость ионного канала у рецепторов с таким составом субъединиц примерно на 30 % выше (28-31 pS), чем у форм α-β. Наличие субъединицы γ2, кроме того, стимулирует формирование кластеров (тесных групп) рецепторов на постсинаптической мембране химических синапсов.

Места связывания ГАМК и бенздиазепинов на ГАМК_А-рецепторе Пентамерная структура протеина демонстрирует расположение α, β и γ-субъединиц в большинстве ГАМК_А-рецепторов. Участки связывания агонистов (синие) формируются на контактной поверхности между субъединицами разных семей, включая в себя несколько аминокислотных остатков как α, так и β субъединиц. Аналогично сформирован единый участок, где связываются бензодиазепины (красный) между α и β субъединицами. Показаны аминокислотные остатки, которые причастны к формированию указанных участков связывания.

В настоящее время считается, что в состав сегмента связывания ГАМК на ГАМК_А-рецепторе входят аминокислотные остатки как от α-, так и β-субъединицы. При этом в составе β-субъединицы для формирования участка связывания ГАМК критическими являются два домена, содержащие аминокислоты YGYT (однобуквенный код, см. статью «аминокислота») — остатки 157—160 субъединицы β₂ (здесь и далее буква обозначает однобуквенный код аминокислоты, цифра — номер остатка в цепи молекулы, начиная с N-конца); и, также, YGSY — остатки 202—205. Однако, согласно некоторым теориям, последний домен может быть ассоциирован с механизмом конформационной передачи в процессе открытия ионного канала, а не собственно с участком связывания ГАМК. Перечисленные выше остатки взаимодействуют с остатками F64, R66, S68, R120 субъединицы α₁ — таким образом, сегмент связывания ГАМК сформирован на поверхности контакта α- и α-субъединиц.

Исследования рекомбинантных рецепторов показали, что одновременное наличие α- и γ-субъединиц является необходимым для возможности аллостерического регулирования ГАМК_А-рецептора с помощью бензодиазепинов. При этом были идентифицированы несколько критически важных аминокислотных остатков — Н101 у α₁-субъединицы и F77 γ₂-субъединицы — которые влияют на активность связывания.

Кроме того, важную роль играет остаток Т142 у субъединицы γ₂, который влияет на эффективность бензодиазепинов. Интересно, что остаток F77 у субъединицы γ₂ гомологичен F64 субъединицы α₁, что имеет активное влияние на эффект ГАМК. Таким образом, сегмент связывания бензодиазепинов, локализованный на поверхности между субъединицами α и γ, возможно, эволюционно возник из участка связывания агониста (то есть ГАМК).

Набор субъединиц, который формирует нативный рецептор, особенно что касается различных изоформ γ и α субъединиц, может оказывать влияние и на фармакологию бенздиазепинов. Лиганды бенздиазепинового ряда могут действовать как частичные или полные агонисты, потенцирующие действие ГАМК; как антагонисты, которые не имеют никакого влияния на действие ГАМК, но предотвращают действие агонистов-бензодиазепинов; и как частичные или полные обратные агонисты, которые ингибируют активацию рецептора с помощью ГАМК, действуя на бенздиазепиновый участок. Эффекты обратных агонистов могут быть ингибированы антагонистами бензодиазепинового ряда. Рецепторы, которые включают α1- и β_іγ₂ субъединицы (где i=1-3), имеют высокое родство к бензодиазепинам, диазепаму, CL218872, и золпидему (часто называются рецепторами или лигандами первого типа). CL218872 и золпидем имеют гораздо более низкое сродство с рецепторами, содержащими α₂-α₃ и α₅β_іγ₂ субъединицы (рецепторы второго типа). Следующая группа рецепторов, α4- и α6βіγ2 — рецепторы, является диазепам-нечувствительной, но способной связывать частичный обратный агонист, Ro-15-4513. В субъединицах α₄ и α₆ отсутствует критически важный для α1 аминокислотный остаток Н101, который заменен на агринин. Такие диазепам-чувствительные рецепторы называются рецепторами третьего типа.

β-субъединицы рецептора сначала считались фармакологически пассивными; тем не менее, недавние исследования показали, что их наличие в составе нативного рецептора является критически необходимым условием для его функционирования, а различные конформации β-субъединиц могут влиять на эффект лигандов, которые с этими субъединицами непосредственно не связаны (например, на эффекты лореклезола). Во всех известных на настоящее время случаях воздействия на эффекты лигандов ГАМК_A-рецептора со стороны его β-субъединиц разница в рецепторном ответе обусловлена мутациями (то есть заменами) одного и того же аминокислотного остатка — на позиции 290 в сегменте ТМ₂. В случае β₁-субъединицы это место занимает серин, и эффект лореклезола при этом не меняется или ингибируется; в случае β₂-субъединицы на этом месте находится аспарагин, который заметно потенцирует (увеличивает) эффект лореклезола и ряда других соединений.

Другой остаток, который сильно влияет на чувствительность αβ-вмещающих ГАМК_A-рецепторов — это Н267, который находится на внешней части домена ТМ₂. Этот остаток гистидина формирует часть сегмента связывания Zn²⁺, делая рецептор чувствительным к ингибированию ионами цинка в концентрации около 100 нМ. Локализация этого аминокислотного остатка внутри хлорного канала рецептора и тот факт, что двувалентный катион цинка может проникать в канал, приспособленный для прохождения одновалентных анионов, независимо от того, активирован рецептор или нет, являются признаками локализации ион-селектирующей части рецепторной молекулы и механизма открытия канала на противоположном конце рецептора.

Таблица 1. Формы ГАМК_A-рецепторов, найденные в нервной системе

Таблица 2. Свойства ГАМК_A-рецепторов

Существуют следующие субъединицы[1]:

• Шесть α субъединиц (GABRA1, GABRA2, GABRA3, GABRA4, GABRA5, GABRA6)
• Три β субъединицы (GABRB1, GABRB2, GABRB3)
• Три γ субъединицы (GABRG1, GABRG2, GABRG3)
• δ-субъединица (GABRD), ε-субъединица (GABRE), π-субъединица (GABRP), θ-субъединица (GABRQ)

• Bormann J (2000): The «ABC» of GABA receptors. Trends Pharmacol Sci 21:16-19.
• Feigenspan A, Wassle H, Bormann J (1993): Pharmacology of GABA receptor Cl^- channels in rat retinal bipolar cells. Nature 361:159-162.
• Fritschy J-M, Mohler H (1995): GABAA receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol 359:154-194.
• Hosie AM, Aronstein K, Sattelle DB, Ffrench-Constant RH (1997): Molecular biology of insect neuronal GABA receptors. Trends Neurosci. 20:578-583.
• Jones A, Korpi ER, McKernan RM, Pelz R, et al. (1997): Ligand-gated ion channel subunit partnerships: GABA_A receptor 6 subunit gene inactivation inhibits delta subunit expression. J Neurosci 17:1350-1362.
• Korpi ER, Grunder G, Luddens H (2002): Drug interactions at GABA_A receptors. Prog Neurobiol 67:113-159.
• Moss SJ, Smart TG (1996): Modulation of amino acid-gated ion channels by protein phosphorylation. Int Rev Neurobiol 39:1-52.
• Rabow LE, Russek SJ, Farb DH (1996): From ion currents to genomic analysis: Recent advances in GABA_A receptor research. Synapse 21:189-274.
• Rudolph U, Crestani F, Benke D, Brunig I, et al. (1999): Benzodiazepine actions mediated by specific γ-aminobutyric acid (A) receptor subtypes. Nature 401:796-800.
• Smith GB, Olsen RW (1995): Functional domains of GABA_A receptors. Trends Pharmacol Sci 16:162-168.
• Whiting PJ, McKernan RM, Wafford KA (1995): Structure and pharmacology of vertebrate GABA_A receptor subtypes. Int Rev Neurobiol 38:95-138.