Протеиназа K

Протеиназа К состоит из 384 аминокислот и содержит два сайта связывания ионов Ca²⁺, которые расположены вблизи активного центра. Для ферментативной активности требует присутствие ионов Ca²⁺ (1 — 5 mM), однако они не принимают непосредственного участия в каталитической реакции.

Фермент расщепляет белки преимущественно по гидрофобным аминокислотам (алифатические, ароматические и другие гидрофобные аминокислоты). Длительная инкубация белков с протеиназой K, также как и при высокой концентрации фермента, приводит к их полному гидролизу. Удаление ионов Ca²⁺ снижает стабильность фермента и его каталитическую активность на 80 %, но остаточная активность сохраняется[3], поэтому протеиназу К можно использовать для очистки нуклеиновых кислот от белков в присутствии ЭДТА.

В молекулярной биологии протеиназа К широко применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК или РНК.

Повышение температуры реакции с 37 °C до 60 °C увеличивает активность протеиназы K в несколько раз, как и при добавление 0,5 — 1 % SDS или гуанидина хлорида (3 M) или гуанидина тиоционата (1 M) или мочевины (4 M)[4]. Так как повышается доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, даже ускоряют их гидролиз.

Протеиназа К работает в широком диапазоне pH (4-12), её оптимум — pH 8.

Температура выше 65 °C или присутствие трихлоруксусной кислоты или сериновых протеаз-ингибиторов AEBSF, PMSF или DFP ингибируют активность.

Протеиназа К не ингибируется в присутствии гуанидина хлорида (до 3 M), гуанидина тиоционата (до 1 M), мочевины (до 4 M), Sarkosyl, Triton X-100, Tween 20, SDS, EDTA, цитрат, йодуксусной кислоты, а также в присутствии ингибиторов сериновых протеаз, как Nα-Tosyl-Lys Chloromethyl Ketone (TLCK) и Nα-Tosyl-Phe Chloromethyl Ketone (TPCK).

Активность протеиназы К в стандартных буферах