PBR322

pBR322 — плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. Создана в 1977 году мексиканскими биологами Франциско Боливаром и Раймондом Родригесом[1].

Карта плазмиды pBR 322

pBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару[2] и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1); гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124) и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причём 2 сайта (HindIII и ClaI) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR. Участок репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1[3]. Он кодирует две РНК (RNAI и RNAII) и один белок (Rom или Rop).

Молекулярная масса плазмиды составляет 2,83⋅106 дальтон[4].

Код в базе данных GenBank — J01749[5].

Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза (англ. penicillin beta-lactamase) с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину[5].

История создания

В 1975 году, когда Франциско Боливар начал работу в Калифорнийском университете в Сан-Франциско в составе группы Герберта Бойера, инструментарий, имевшийся в распоряжении молекулярных биологов, был крайне беден. Векторы клонирования имели очень большую молекулярную массу, их свойства были плохо изучены, удобные сайты клонирования отсутствовали[6].

Группа Бойера, в состав которой входило несколько талантливых биологов, занималась клонированием и изучением некоторых специфических генов. Однако работа продвигалась крайне медленно из-за отсутствия удобных инструментов, в первую очередь векторов клонирования, а также достаточно чистых эндонуклеаз рестрикции и ДНК-лигазы Т4. Со временем некоторые члены группы пришли к мысли о создании более совершенного инструментария.

В первое время Бойер не одобрял занятий своих сослуживцев, и большую часть работы пришлось проделать в нерабочее время. Однако когда плазмида pBR322 была создана, он стал активным сторонником и пропагандистом нового инструмента, заменив им использовавшуюся ранее плазмиду pMB9. Новая плазмида быстро распространилась по научному сообществу, в течение первых дней её получили более 300 лабораторий по всему миру. Оригинальный метод клонирования путём деактивации генов сопротивляемости к антибиотикам позволял легко планировать эксперименты и быстро анализировать полученные данные.

В то время проблемы биологической безопасности считалась чрезвычайно актуальными, поэтому плазмида была создана с сильно ограниченными возможностями распространения за пределами лаборатории. Она стала первым вектором типа EK2, сертифицированная Национальным институтом здоровья как соответствующая требованиям безопасности для рекомбинантных ДНК.

Наконец, очень сильно способствовало популярности новой плазмиды расшифровка и опубликование в 1979 году её нуклеотидной последовательности, сделанное Грегом Сатклиффом (англ. Greg Sutcliffe) из лаборатории Уолтера Гилберта[7].

В течение десятилетий pBR322 активно использовалась в генных исследованиях. Её кодовая последовательность и функции генов были настолько хорошо изучены, что стали использоваться как компоненты при создании новых инструментальных плазмид.

Оригинальная статья в журнале Gene[1], где было описано создание плазмиды, стала одним из лидеров по числу цитирований среди статей по молекулярной биологии в 1970-х и начале 1980-х годов[8].

Структура плазмиды

Нуклеотидная последовательность

Нуклеотидная последовательность pBR322 следующая[5]

pBR322 
       1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA
      61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG
     121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT
     181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA
     241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG
     301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC
     361 CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG GCCGGCATCA CCGGCGCCAC
     421 AGGTGCGGTT GCTGGCGCCT ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGATC GGGCTCGCCA
     481 CTTCGGGCTC ATGAGCGCTT GTTTCGGCGT GGGTATGGTG GCAGGCCCCG TGGCCGGGGG
     541 ACTGTTGGGC GCCATCTCCT TGCATGCACC ATTCCTTGCG GCGGCGGTGC TCAACGGCCT
     601 CAACCTACTA CTGGGCTGCT TCCTAATGCA GGAGTCGCAT AAGGGAGAGC GTCGACCGAT
     661 GCCCTTGAGA GCCTTCAACC CAGTCAGCTC CTTCCGGTGG GCGCGGGGCA TGACTATCGT
     721 CGCCGCACTT ATGACTGTCT TCTTTATCAT GCAACTCGTA GGACAGGTGC CGGCAGCGCT
     781 CTGGGTCATT TTCGGCGAGG ACCGCTTTCG CTGGAGCGCG ACGATGATCG GCCTGTCGCT
     841 TGCGGTATTC GGAATCTTGC ACGCCCTCGC TCAAGCCTTC GTCACTGGTC CCGCCACCAA
     901 ACGTTTCGGC GAGAAGCAGG CCATTATCGC CGGCATGGCG GCCGACGCGC TGGGCTACGT
     961 CTTGCTGGCG TTCGCGACGC GAGGCTGGAT GGCCTTCCCC ATTATGATTC TTCTCGCTTC
    1021 CGGCGGCATC GGGATGCCCG CGTTGCAGGC CATGCTGTCC AGGCAGGTAG ATGACGACCA
    1081 TCAGGGACAG CTTCAAGGAT CGCTCGCGGC TCTTACCAGC CTAACTTCGA TCACTGGACC
    1141 GCTGATCGTC ACGGCGATTT ATGCCGCCTC GGCGAGCACA TGGAACGGGT TGGCATGGAT
    1201 TGTAGGCGCC GCCCTATACC TTGTCTGCCT CCCCGCGTTG CGTCGCGGTG CATGGAGCCG
    1261 GGCCACCTCG ACCTGAATGG AAGCCGGCGG CACCTCGCTA ACGGATTCAC CACTCCAAGA
    1321 ATTGGAGCCA ATCAATTCTT GCGGAGAACT GTGAATGCGC AAACCAACCC TTGGCAGAAC
    1381 ATATCCATCG CGTCCGCCAT CTCCAGCAGC CGCACGCGGC GCATCTCGGG CAGCGTTGGG
    1441 TCCTGGCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG
    1501 GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC
    1561 TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG
    1621 TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA
    1681 GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA
    1741 CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA
    1801 CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT
    1861 TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC
    1921 AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT
    1981 CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC
    2041 GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC
    2101 CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC
    2161 AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC
    2221 CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG
    2281 TACTGAGAGT GCACCATATG CGGTGTGAAA TACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC
    2341 GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC
    2401 GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA
    2461 ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG
    2521 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT
    2581 CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA
    2641 GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC
    2701 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT
    2761 AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG
    2821 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG
    2881 CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT
    2941 TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC
    3001 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG
    3061 CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC
    3121 AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT
    3181 AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA
    3241 AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT
    3301 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT
    3361 GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG
    3421 CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG
    3481 CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA
    3541 ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG
    3601 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG
    3661 GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT
    3721 CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA
    3781 TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG
    3841 GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC
    3901 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG
    3961 GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA
    4021 TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG
    4081 GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT
    4141 GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC
    4201 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA
    4261 CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT
    4321 ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAAGA A                    

Гены

Источник информации[9].

ГенНуклеотидная
последовательность		ИсточникПримечание
tet (TcR)86—1276pSC101Устойчивость к тетрациклину
bla (ApR)4153—3293Tn3Устойчивость к ампициллину
rop1915—2106pMB1Белок Rop
ori3122—2534pMB1Участок репликации

Сайты рестрикции

Жирным шрифтом выделены уникальные сайты[9].

По координатамПо алфавиту
СайтКоординатаГенСайтКоординатаГен
ClaI-BspDI23AatII-ZraI4284
HindIII29AcuI3000ori
EcoRV185tetAcuI4048amp
BmtI-NheI229tetAhdI3361amp
BamHI375tetAlwNI2884ori
SgrAI409tetAseI3537amp
BanII471tetAvaI-BsoBI1425
BanII485tetBamHI375tet
BtgI528tetBanII471tet
SphI562tetBanII485tet
EcoNI622tetBciVI2682ori
SalI-AccI-HincII651tetBciVI4209
PshAI712tetBmtI-NheI229tet
EagI939tetBsaAI2225
BseYI949tetBsaBI1668
NruI972tetBsaI3433amp
BstAPI1045tetBseYI949tet
BspMI-BfuAI1063tetBseYI2777ori
PflMI1315BsgI1650
BsmI1353BsmBI2122
PflMI1364BsmI1353
StyI1369BspEI1664
AvaI-BsoBI1425BspMI-BfuAI1063tet
PpuMI1438BspQI-SapI2350
MscI1444BsrBI2404
BtgI1447BsrBI4205
PpuMI1480BsrDI3420amp
BsgI1650BsrDI3602amp
BspEI1664BstAPI1045tet
BsaBI1668BstAPI2291
XmnI2029ropBstZ17I-AccI2244
PvuII2064ropBtgI528tet
BsmBI2122BtgI1447
DrdI2162BtsI3759amp
Tth111I-PflFI2217BtsI3787amp
BsaAI2225ClaI-BspDI23
BstZ17I-AccI2244DrdI2162
BstAPI2291DrdI2575ori
NdeI2295EagI939tet
BspQI-SapI2350EarI2351
EarI2351EarI4155
BsrBI2404EcoNI622tet
PciI-AflIII2473EcoRI4359
DrdI2575oriEcoRV185tet
BciVI2682oriHincII3905amp
BseYI2777oriHindIII29
AlwNI2884oriMscI1444
AcuI3000oriNdeI2295
AhdI3361ampNruI972tet
BsrDI3420ampPciI-AflIII2473
BsaI3433ampPflMI1315
AseI3537ampPflMI1364
BsrDI3602ampPpuMI1438
PstI3607ampPpuMI1480
PvuI3733ampPshAI712tet
BtsI3759ampPstI3607amp
BtsI3787ampPvuI3733amp
ScaI3844ampPvuII2064rop
HincII3905ampSalI-AccI-HincII651tet
XmnI3961ampScaI3844amp
AcuI4048ampSgrAI409tet
EarI4155SphI562tet
SspI4168SspI4168
BsrBI4205StyI1369
BciVI4209Tth111I-PflFI2217
AatII-ZraI4284XmnI2029rop
EcoRI4359XmnI3961amp

Плазмида pBR322 в массовой культуре

По сюжету романа Майкла Крайтона «Парк юрского периода» части плазмиды pBR322 используются для воссоздания ДНК динозавров[10]. Хотя само название плазмиды не упоминается на страницах книги, там приводится последовательность нуклеотидов, являющаяся по сюжету фрагментом восстановленной ДНК динозавра. Поиск в базе данных GenBank при помощи поисковой программы BLASTN находит большое количество совпадений с генной последовательностью pBR322.

См. также

Ссылки

Примечания
  1. Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa J.H., Falkow S. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system (англ.) // Gene : journal. — Elsevier, 1977. — Vol. 2, no. 2. — P. 95—113. — PMID 344137.
  2. Watson, N. A new revision of the sequence of plasmid pBR322 (англ.) // Gene. — Elsevier, 1988. — Vol. 70, no. 2. — P. 399—403. — doi:10.1016/0378-1119(88)90212-0. — PMID 3063608.
  3. Qiagen Plasmid Resource Center. Growth of Bacterial Cultures (недоступная ссылка). Архивировано 16 октября 2005 года.
  4. pBR322 Vector Архивировано 13 октября 2010 года..
  5. pBR322 Nucleotide Sequences, NCBI Sequence Viewer v2.0.
  6. Все материалы данного раздела, кроме абзацев, где источник указан особо, взяты из статьи Francisco Bolivar Zapata. Multipurpose Tools in Molecular Biology (неопр.) // Current Contents. — November 19, 1990. — Т. 47. — С. 12.
  7. Sutcliffe J. G. (1979) Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77—80, PMID 383387.
  8. Garfield E. (1 October 1984) The articles most cited in 1961-1982. 4. 100 additional Citation Classics. Current Contents, 40: 3—9.
  9. Restriction Maps. pBR322 Архивировано 26 июня 2011 года..
  10. Mark Boguski. A Molecular Biologist Visits Jurassic Park (англ.) // Biotechniques : journal. — 1992. — Vol. 12. — P. 668—669. Архивировано 20 ноября 2008 года.
This article is issued from Wikipedia. The text is licensed under Creative Commons - Attribution - Sharealike. Additional terms may apply for the media files.