Куэйл, Джон Родни

После Кембриджа Джон поменял область научных исследований на энзимологию и биохимию бактерий.

Он начал исследование бактерий и дрожжей, которые растут за счет использования в качестве энергии вещества, содержащие один атом углерода, такие как метан, метанол и метиламин. Когда Джон только приступал к работе было описано очень мало таких организмов, но было известно, что существуют различные виды бактерий, которые используют разнообразные метаболические пути для получения энергии.

Все живые организмы можно разделить на авто- и гетеротрофов. Автотрофы используют оксид углерода в качестве единственного источника энергии для роста, в то время как гетеротрофы — органические источники углерода. Метилотрофы — это большая группа гетеротрофов, которые растут за счет восстановленных форм С₁ соединений.

В 1953 году Джон получил грант Fulbright Travel Grant для работы с Мелвином Кальвином на химическом факультете Университета Калифорнии в Беркли. Там они изучали первую стадию энзим-каталитического процесса ассимиляции диоксида углерода в растениях.

В лаборатории Кельвина был установлен путь фотосинтеза для ассимиляции оксида углерода в растениях, который теперь известен, как цикл Кальвина-Бенсона.

Джон стал автором публикации[3], которая до сих пор считается доказательством существования этого цикла. Вместе с коллегами они показали, что растения, в которых зафиксирован оксид углерода, меченный ¹⁴С, с помощью карбоксилирования 1,5-бисфосфата рибулозы (RuBP) (впервые синтезированной Джоном) дают промежуточный продукт С₆, который расщепляется на 2 соединения С₃.

Он показал, что бесклеточные экстракты зеленых водорослей Chlorella, обработанные меченным CO₂ в течение 1 минут, образуют меченные фосфоглицераты при добавлении RuBP. И этот фосфоглицерат не образовывался при использовании других фосфатов сахаров.

В результате был сделан вывод, что экстракты содержат фермент (или ферменты), способные катализировать карбоксилирование дифосфата рибулозы, в частности для образования фосфоглицериновой кислоты.

Это было первое описание активности фермента, теперь известного, как рибулоза бисфосфат карбоксилаза (RuBisCo), который является самым распространенным ферментом на Земле.

В Беркли Джон впервые встретил Ханса Корнберга, с которым впоследствии сотрудничал в Оксфорде.

В 1955 году Род со своей женой Ивонн вернулись в Англию, где он принял должность старшего научного сотрудника в институте DSIR’s Tropical Products в Лондоне для изучения химии природных пиретрин инсектицидов. Эта работа не сильно вдохновляла Рода, но в этом же году он случайно встретился с Хансом Корнбергом, который предложил ему подать заявку на должность в отдел исследований клеточного метаболизма, которым заведовал Кребс, в Оксфордском университете.

Там он совместно с Корнбергом предложил новый глиоксилатный цикл для роста бактерий на соединениях С₂. В результате этих исследований его основной областью работы стала биохимия и физиология бактерий, растущих на соединениях С₁, таких как формиат, метан, метанол и метиламин.

В 1957 году он начал читать лекции по биохимии в Оксфордском университете, таким образом став полноправным членом научного сообщества университета.

Ханс Корнберг провел исследование того, как бактерии способны расти на ацетате-соединении С₂. Цикл трикарбоновой кислоты (также известный, как цикл Кребса) используется для окисления ацетата до СО₂, однако ацетат также должен быть преобразован в соединения С₃ и С₄ для ассимиляции в клеточный материал. Чтобы этого достичь нужны дополнительные ферменты, которые пополняют цикл, когда промежуточные продукты удаляются для биосинтеза.

В 1957 году Корнберг и Кребс предположили существование глиоксилатного цикла, который включает два ключевых анаплеротических («заполняющих») фермента — изоцитратлиазу и малатсинтазу[4].

Они показали, что оба фермента присутствуют в бесклеточных экстрактах ацетатных бактерий.

Однако было необходимо продемонстрировать, что цикл функционирует в естественных условиях. Род вместе с Корнбергом воспользовались методами хроматографии, чтобы разделить и охарактеризовать путем химической деградации промежуточные продукты, образованные из ¹⁴С-меченного ацетата и СО₂.

Оказалось, что распределение изотопов поддерживает одновременную работу цикла Кребса и глиоксилатного цикла[5].

Впоследствии Род использовал те же методики для изучения метилотрофных путей. После первоначального сотрудничества Род и Ханс Корнберг провели независимые исследования метаболизма соединений С₂ более окисленных, чем ацетат.

Вместе с австралийским коллегой Брюсом Кичем, Род исследовал пути, по которым Pseudomonas oxalaticus растет на оксалате — наиболее оксиленном соединении С₂. Они описали, как оксалат восстанавливается до глиоксилата, а затем превращается в глицерат по глицератному пути.

Глицератный путь был обнаружен Корнбергом и его учеником Тони Готто, который работал с выращенным на гликолате Pseudomonas ovalis. В 1959 году они опубликовали 2 статьи по бактериальному росту в Nature.

В последней статье в этой серии экспериментов сам Род показал, что энергия для роста приходит от декарбоксилирования оксалил-кофермента А до образования диоксида углерода.

Ключевым промежуточным звеном в этом процессе является крошечная формильная группа, связанная с двумя большими коферментам — коферментом А и тиаминпирофосфатом.

Pseudomonas oxalaticus также способен расти на формиате в качестве единственного источника углерода и энергии. Род вместе с Брюсом Кичем показали, что соединение C₁ ассимилируется в клеточный материал через цикл Кальвина-Бенсона (фотосинтез). Фосфоглицерат оказался первым промежуточным продуктом в ассимиляции [¹⁴C] формиата или [¹⁴C] бикарбоната, причем формиат окислялся до углекислого газа до ассимиляции в клеточный материал. Эксперименты, похожие на те, которые он проводил в лаборатории Кальвина с использованием экстрактов хлореллы, подтвердили наличие ключевого фермента рибулозобисфосфаткарбоксилазы вместе с фосфорибулокиназой во время роста P.oxalaticus на формиате, но не на оксалате. Примерно через 15 лет Род показал, что некоторые метилотрофы (такие как Paracoccus denitrificans) также растут на метаноле посредством рибулозно-бисфосфатного пути (путь фотосинтеза Кальвина-Бенсона).

Род отмечал, что его исследование метилотрофных микробов могло бы пойти по другому пути, если бы он начал работать с Paracoccus вместо того, чтобы выделить собственный микроорганизм, Pseudomonas AM (в настоящее время Methylobacterium extorquens AM1). Этот организм был изначально выдел на метиламиновой среде в 1960 году его первым учеником Дэвидом Пилом. В течение последних 50 лет Methylobacterium extorquens AM1 является основным рабочим организмом для тех, кто работает в области биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии бактерий, растущих на метаноле. Род использовал те же экспериментальные подходы, которые он разработал, чтобы подтвердить работу глиоксилатного цикла во время роста на ацетате и глицератного пути для ассимиляции оксалатов.

Со своими учениками Питером Ларжем и Дэвидом Пилом в серии экспериментов[6][7], он показал, что метанол ассимилируется в Pseudomonas AM1 (и в Hyphomicrobium vulgare) через новый ассимиляционный путь, так называемый сериновый цикл, в котором количество метанола зависит от уровня окисления формальдегида в серин и от уровня превращения диоксида углерода в оксалоацетат. Это исследование включало идентификацию ранних промежуточных продуктов, полученных путем инкубации выращенных в метаноле бактерий с [¹⁴C] метанолом или [¹⁴C] бикарбонатом. Положение изотопа в выделенных меченых соединениях (серин, глицин, аспартат и др.) определялось путем химической деградации и последующего анализа.

Этот путь был установлен после открытия и детального описания новых специфических ферментов, характерных для этого пути. Важность этих ферментов была подтверждена во время изучения их индукции в течение метилотрофного роста и их отсутствия у мутантов, не способных расти на метаноле. В середине 1970-х годов сериновый цикл, казалось, был изучен до конца, за исключением понимания того, как ацетилкофермент А окисляется до глиоксилата. Этот важный шаг не могли объяснить в течение последующих 30 лет. Только в 2006 году, вскоре после того, как Род умер, появилось описание полного пути, которое сделали Джордж Фукс и группа Фрайбурга[8].

После переезда в Шеффилд в 1963 году Род начал изучать метанотрофы — то есть, бактериальные метилотрофы, которые обычно растут только на метане, но иногда также на метаноле. В их первой статье о сериновом цикле в утилизаторах метанола он задался вопросом, является ли метаболизм при росте микроорганизмов на метане схожим с ростом на метаноле[7]. Это было особенно актуально для метанотрофов, так как ранее предполагалось, что метан ассимилируется в виде диоксида углерода с помощью RuBP пути фиксации углекислого газа.

Если бы Род решил изучать другой метанотроф, он мог бы прийти к очевидному выводу, что все метилотрофы, включая метанотрофы, будут использовать сериновый цикл для ассимиляции метана, также как и для метанола. Но его первая статья, сделанная во время работы в Шеффилде (с Пэт Джонсон) показала, что ни один из известных путей не работает[9].Во время роста на метане, рибулозобисфосфаткарбоксилаза отсутствовала у Pseudomonas methanica (сейчас Methylomonas methanica) и соединения, меченные ¹⁴C, накапливающиеся на ранних стадиях инкубации с [¹⁴C] метаном или [¹⁴C] метанолом, не были ни фосфоглицератом, ни серином, а в основном были фосфатами либо глюкозы, либо фруктозы. Они описали новый формальдегид-конденсирующий фермент в неочищенных клеточных экстрактах, который указывает на наличие пентозофосфатного цикла для ассимиляции формальдегида — аналога RuBP пути для ассимиляции диоксида углерода. Вместе со своим учеником Майклом Кемпом Род охарактеризовал новый фермент, ответственный за конденсацию формальдегида с монофосфатом рибулозы с получением фосфата сахара.

Позже этот фосфат сахара был идентифицирован как новый фосфат гексулозы, d-арабино-3-гексулоза фосфат[10]. В конечном итоге Род завершил описание этого пути, теперь известного как рибулоза монофосфатный путь (путь RuMP), путем очистки и описания второго ранее неизвестного фермента, гексулозофосфатизомеразы. Тем самым он продемонстрировал наличие необходимых ферментов расщепления и перегруппировки[11].

Таким образом, три молекулы формальдегида конденсируется с RuBP с образованием трех молекул фосфата гексулозы, которые затем подвергаются серии реакций расщепления и перегруппировки для регенерации акцепторного монофосфата рибулозы и получения фосфоглицерата С3 для ассимиляции в клеточный материал.

После этого первого описания пути RuMP у метанотрофов, растущих на метане, было показано, что RuMP является основным путем ассимиляции метанола у многих бактерий, включая Methylophilus methylotrophus — бактерии, которую использовала компания Imperial Chemical Industries (ICI) для их проекта Pruteen. Это было важно, так как RuMP путь оказался более выгодным, чем сериновый цикл для роста бактерий на метаноле, как в энергетическом плане, так и в коммерческом.

Он также продемонстрировал, что, имея дополнительный фермент (6-фосфоглюконатдегидрогеназу) в пути, некоторые из этих бактерий могут окислять формальдегид в CO₂ циклическим путем вместо обычного линейного пути. Род показал, что есть четыре возможных варианта пути RuMP в зависимости от того, какая перегруппировка реакции действуют[11].

Хотя Род показал, что путь RuMP работает у некоторых других метанотрофных видов, вскоре он получил доказательства того, что, по крайней мере, один из них должен использовать другой путь. Эксперименты по мечению Methanomonas methanooxidans показали, что серин и карбоновые кислоты являются продуктами с ранней меткой, также как и для ассимиляции метанола в Pseudomonas AM1, и ключевые ферменты серинового цикла присутствуют во время роста на метане, тогда как пути RuMP отсутствуют.

Это позволило предположить, что существуют две группы метанотрофных бактерий с разными метаболическими путями. В 1970 году был достигнут еще один важный этап в метаболизме С₁, когда Роджер Уиттенбери, Джон Уилкинсон и их коллеги выделили и охарактеризовали более 100 новых штаммов[12]. После чего они сформировали две отдельные группы бактерий в зависимости от расположения их внутренних мембран. В результате их открытий Род подтвердил, что бактерии из первой группы используют путь RuMP, а из второй — сериновый цикл[13].

В конце 1970-х годов Род начал изучать недавно описанные метанол-утилизирующие метилотрофные дрожжи[11]. В 1977 году Ханс ван Дейкен из Университета Грёнингена провел год в Шеффилде, и Род, вместе с другими коллегами из Грёнингена и Шеффилда, решил изучить литературу, предполагающую, что Candida использует RuMP путь во время роста на метаноле[14]. Они повторили эксперименты по мечению с [¹⁴C] метанолом, используя Hansenula polymorpha вместо Candida, и получили идентичные результаты для двух дрожжей. Однако в бесклеточных экстрактах, выращенных в метаноле H. polymorpha и Candida boidinii, не хватало двух основных ферментов RuMP пути, а именно гексулозы монофосфатсинтазы и гексулозофосфатизомеразы. Они были исследованы с использованием природных субстратов и чувствительных спектрофотометрических методов, которые разработал Род для бактериальных ферментов. Таким образом, хотя эксперименты по мечению ¹⁴C и присутствию в бесклеточных экстрактах ферментной системы, способной катализировать пентозофосфат-зависимую фиксацию формальдегида, указывает на дрожжевой аналог бактериального пути RuMP — отсутствие незаменимых ключевых ферментов показало, что это не так.

Роджер Кокс доказал возможность того, что пентозофосфат-зависимый фиксация формальдегида в неочищенных экстрактах может быть катализирована транскетолазой с использованием ксилулозы 5-фосфат, как донора кетола, и формальдегида, как акцептора.

Вместе с Леном Затманом, он рассмотрел эту реакцию во время их исследования роста бактерии 2B2 на триметиламине[15]. На основании такой реакции конденсации Род и его коллеги предложили другой новый ассимиляционный цикл, цикл дигидроксиацетона для формальдегидной фиксации, в которой дигидроксиацетон будет основным продуктом, образованным из формальдегида[14].

При росте на метаноле требуются более высокие активности дигидроксиацетонкиназы и фруктозо-1,6-бисфосфатазы, чем при росте на многоуглеродистых субстратах, и это подтвердилось у метилотрофных видов Hansenula и Candida. Затем Мэри О’Коннор, которая стажировалась в их лаборатории, показала, что мутанты H. polymorpha и C. boidinii, лишенные дигидроксиацетонкиназы, не могут расти на метаноле[16].

Обширные исследования Рода, такие как пути ассимиляции у бактерий и дрожжей, иногда приводили к открытиям в смежных областях.

Одним из примеров таких открытий служит его работа по окислению метана с доктором Джоном Хиггинсом. Метан довольно химически инертен, и поэтому они предположили, что первая окислительная стадия в его метаболизме будет катализироваться монооксигеназой с энергией, вводимой в реакцию восстановителем NADH. Это было очень трудно подтвердить с помощью обычных биохимических методов, но Род предложил решить эту проблему, используя «тяжелый кислород» (¹⁸O), как в качестве газа, так и в качестве составной части воды. В 1970 году с Хиггинсом он однозначно показал, что начальная реакция катализируется монооксигеназой, включающей ¹⁸O в метанол из ¹⁸O₂, но не от H₂¹⁸О.

Род провел годичный отпуск в качестве приглашенного профессора в Геттингене (1973-74), работая с профессором Герхардом Готшалком, профессором Норбертом Пфеннигом и профессором Хансом Шлегелем в знаменитом Институте Микробиологии в Университете Георга Августа. Норберт Пфенниг показал, что некоторые представители фотосинтетических бактерий (Rhodospirillaceae) используют метанол вместо углекислого газа в качестве источника углерода во время анаэробного фотосинтеза. Во время своего визита Род нашел лучший способ выделить эти бактерии и показал, что вполне вероятно (как теперь подтверждено), что они ассимилируют углерод из метанола после первого его окисления до углекислого газа.

По возвращению домой он сотрудничал с Германом Сэмом и Роджером Коксом, чтобы подтвердить, что путь RuBP действительно используется для роста на метаноле после его первоначального окисления до углекислого газа. Во время этого процесса метанол окисляется NAD±зависимой хинопротеин метанолдегидрогеназой, которая передает свои электроны специальному цитохрому с, а затем, в аэробных условиях, к кислороду. Тем не менее, измерение роста дрожжей при анаэробном фотосинтезе на метаноле[17] показали, что дегидрогеназа также ответственна за восстановление NAD + до NADH, что необходимо для усвоения углекислого газа, образующегося при окислении метанола. Этот процесс включает в себя окисление цитохрома с комплексом цитохрома bc1, убихиноном и НАДГ дегидрогеназой. Таким образом, это является редким примером «обратного транспорта электронов» из метанола у бактерий, энергия которых обеспечивается световыми реакциями фотосинтеза[18]

Ханс Кребс был заведующим кафедры биохимии в Шеффилдском университете (1938- 54 гг.), где он часто использовал микроорганизмы в своих исследованиях, оценивая их многочисленные преимущества для изучения клеточного метаболизма. В 1948/49 гг. он помог организовать кафедру микробиологии в составе отдела Бактериологии. Кафедра микробиологии была официально создана в 1952 году. В течение первых 13 лет (1952—1965 гг.) кафедра микробиологии получила международное признание за исследования в области биохимии анаэробных и фотосинтетических бактерий и энергетики бактериального роста.

В 1954 году Кребс переехал с большинством своих сотрудников из Шеффилда в Оксфорд. В 1963 году в результате предстоящей отставки Кребса из Оксфорда, Род принял приглашение переехать с Бартли в Шеффилд в качестве старшего преподавателя кафедры микробиологии.

Два года спустя Род был назначен главой кафедры микробиологии (1965-83 гг.). Вместе с Джоном Гестом, Маргарет Этвуд и Питером Уайтом, а также Бернардом Фраем в качестве старшего преподавателя, они представляли весь научно-педагогический состав кафедры в течение следующих 10 лет. К ним позже присоединились Милтон Уэйнрайт (1975) и Энн Моир (1981), в итоге общее количество сотрудников достигло семи.

Из-за того, что не было места для дополнительного персонала или оборудования было сложно подать заявку на исследовательские гранты. Это было тяжелое время так как микробиология, включая микробную и молекулярную генетику, развивалась с бешенной скоростью, предоставляя материалы и методы для генетической революции и зарождая эру рекомбинантной ДНК. Поэтому было важно начать реформировать кафедру микробиологии в этом направлении.

В 1972 году были выделены дополнительные места для преподавательской деятельности на кафедре и для исследований. Все на кафедре микробиологии, включая Рода, имели большую учебную нагрузку и продолжали преподавать курс биохимии. В 1966 году они организовали новый двойной диплом со специализацией в области генетики и микробиологии на отделении генетики.

Курсы включали широкий ряд тем, отражающие опыт сотрудников в микробной структуре, функциях, физиологии и метаболизме, кинетике и энергетике роста, микробиологии окружающей среды, бактериальной и фаговой молекулярной биологии и молекулярной генетике, а также включая генную инженерию и биотехнологию. Род был отличным руководителем отдела, всегда доступным и дружелюбным ко всем. Регулярно посещая еженедельные семинары, он постоянно следил за исследованиями всех сотрудников и их учеников. Благодаря этому небольшая кафедра смогла многого достигнуть, в том числе два сотрудника (Куэйл и Гест) из семи были избраны членами Королевского общества.

Через двадцать лет после переезда из Оксфорда в Шеффилд Род понял, что многого достиг в областях, в которых он был заинтересован, и после рассмотрения нескольких позиций он переехал в Университет Бата в качестве вице-канцлера.

В это время происходили значительные изменений в реструктуризации управления высшим образованием, поэтому Род пришлось приспособиться к роли бизнесмена и руководителя.

Род обладал теми качествами, благодаря которым люди могли понимать и следовать назначенным целям. Через некоторое время в 1985 году советом университета ему было поручено за три года провести изменения в организации университета. В результате чего уже через один год Университет Бата был преобразован из высоко централизованного университета в университет с одним руководством и заведующими разными кафедрами. В течение девяти лет под его руководством университет Бата стал выдающимся исследовательским университетом с 11 из 14 исследовательскими школами в рейтинге лучших университетов Великобритании.

Несмотря на участие во всех аспектах жизни университета, Род также продолжал интересоваться исследованиями из его собственной области научных интересов — бактериального метаболизма соединений С₁. Даже когда он не мог присутствовать на международных конференциях, он всегда хотел услышать отчеты о последних достижениях.

Отношения Рода со студентами были особенными. Он всегда прислушивался к потребностям студентов.

Также он был избран председателем Национального комитета по микробиологии Великобритании (1985-90 гг.), консультируя правительство Великобритании по всем микробным вопросам, и он занимал пост президента Общества по общей микробиологии с 1990 по 1993 год. А также Род продолжал работать на различных должностях в Королевском Обществе за несколько месяцев до своей смерти. Он был членом Совета Батского института медицинской инженерии, который использовал междисциплинарный подход в медицине, технике и науке для определения потребностей людей с ограниченными возможностями.