Конфокальная микроскопия

Схема конфокального микроскопа. Рассеянный свет, идущий из глубины образца (пунктирные линии синего цвета), отрезаются апертурами, что обеспечивает высокий контраст изображения

Оптическая схема обычного светового микроскопа формирует изображение всей части образца, находящегося в ГРИП используемого микрообъектива, а конфокальный микроскоп формирует изображение очень тонкого среза объекта на одном уровне глубины. По сути, метод КЛСМ достигается за счет контролируемого ограничения глубины фокуса оптической системы.

Принцип конфокальной визуализации был запатентован в 1957 году Марвином Минским[28][29] и направлен на преодоление некоторых ограничений традиционных флуоресцентных микроскопов. В обычном (широкопольном) флуоресцентном микроскопе весь образец равномерно освещается источником излучения микроскопа. При этом происходит одновременное облучение и возбуждение всего образца, а результирующая флуоресценция детектируется с помощью фотоприемника или камеры микроскопа, включая большую фоновую часть объекта. Напротив, конфокальный микроскоп использует точечную подсветку (см. Функция Размытия Точки, Point Spread Function) и пинхол в оптически сопряженной плоскости перед детектором для исключения внефокусного сигнала. Таким образом, происходит детектирование флуоресцентного излучения только из фокальной плоскости, поэтому оптическое разрешение изображения, особенно вдоль оси Z (по глубине образца), намного выше, чем у обычных световых микроскопов. Однако, поскольку большая часть флуоресценции от образца диафрагмируется, увеличению разрешения сопутствует снижение интенсивности полезного сигнала. Для компенсации этого побочного эффекта используют более длительную экспозицию детектора и высокочувствительные фотоприемники, как правило ФЭУ или лавинный фотодиод, которые преобразуют оптический сигнал в электрический, с последующей регистрацией на персональном компьютере[30].

Поскольку на образце регистрируется только одна флуоресцирующая точка, то для формирования двумерного или трехмерного изображения требуется растровое сканирование образца. Лазерный пучок перемещается по образцу в горизонтальной плоскости с использованием одного или нескольких зеркал с управляемым углом наклона. Этот метод сканирования обычно имеет низкую скорость сканирования, которая, однако, может варьироваться. Так, более медленное сканирование обеспечивает лучшее соотношение сигнал/шум, что приводит к лучшему контрасту и более высокому разрешению.

Как известно, ГРИП КЛСМ прямо пропорциональна длине волны используемого излучения и обратно пропорциональна числовой апертуре микрообъектива, а также зависит от оптических свойств образца. Благодаря этому в КЛСМ с помощью различных алгоритмов происходит программная реконструкция точки 3D-объектов. Наиболее распространенным является алгоритм поиска максимума интенсивности.[31]

Конфокальный микроскоп имеет разрешение ${\displaystyle \delta }$ такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом.

${\displaystyle \delta ={\frac {\lambda }{\pi (NA)}}}$

где ${\displaystyle \lambda }$ — длина волны излучения, ${\displaystyle (NA)=n\sin \alpha }$ — числовая апертура объектива, ${\displaystyle n}$ — показатель преломления среды между образцом и объективом, ${\displaystyle \alpha }$ — половина угла, который «захватывает» объектив. В видимом диапазоне разрешение составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51).Однако в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3—10 нм[32][33][34][35].

Рассмотрим теперь вопрос увеличения контрастности при использовании конфокальной оптической схемы. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF) имеет следующий вид:

${\displaystyle Pconf(\xi ,\rho )=p(\xi ,\rho )\times p(\xi ,\rho )}$,

где Pconf — конфокальная функция размытия точки, а p — обычная функция размытия точки.

Визуализация GFP-меченых белков вируса в табачном листе с помощью конфокальной микроскопии

Таким образом, достижимая толщина фокальной плоскости определяется в основном длиной волны используемого излучения, деленной на числовую апертуру объектива, а также зависит от оптических свойств образца. Благодаря тонкому оптическому срезу эти типы микроскопов особенно хороши для 3D-визуализации и поверхностном профилировании образцов.

Последовательные срезы формируют «z-стек», который может быть обработан определенным программным обеспечением для создания реконструированного 3D-изображения или представлен в двухмерном стеке для публикации, благодаря распространенному алгоритму поиска максимума интенсивности.[31]

Конфокальная микроскопия обеспечивает возможность прямого, неинвазивного последовательного оптического секционирования интактных толстых живых образцов с минимальными требованиями к их подготовке, а также более высокое латеральное разрешение в сравнении с обычной световой микроскопией[36][37]. Как правило, биологические образцы контрастируют флуоресцентными красителями, чтобы визуализировать их определенные области или органеллы. При этом фактическая концентрация красителя может быть очень низкой, чтобы свести к минимуму воздействие на биологические системы. Так, некоторые конфокальные системы могут отслеживать отдельные флуоресцентные молекулы[38]. Кроме того, трансгенные технологии могут создавать организмы, которые продуцируют свои собственные флуоресцентные химерные молекулы (меченые GFP, green fluorescent protein)[39].

Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты (динамику) клеточной активности в четырёх измерениях — высота, ширина, глубина и время.[40]

Функция размытия точки (PSF) в конфокальном микроскопе

Многоканальная спектральная конфокальная микроскопия. Органеллы в клетках Marchantia polymorpha thallus

Применяя критерий Релея для разрешения (провал 26 % от максимума распределения), мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа разрешение (r_c) определяется следующим образом[8][41]:

${\displaystyle r_{c}=0.44{\lambda \over n\cdot sin\Theta }=0.88{\lambda ' \over D}\cdot F}$,

где n — относительный показатель преломления, D — диаметр входного зрачка оптической системы, λ — длина волны, F — фокусное расстояние микрообъектива, θ - апертурный угол микрообъектива, λ'=λ/n. Для обычного светового микроскопа разрешение (r_r):

${\displaystyle r_{r}=0.61{\lambda \over n\cdot sin\Theta }=1.22{\lambda ' \over D}\cdot F}$

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде главного максимума составляет 2 %, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0,04 %.

Конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет использования сфокусированной подсветки (возбуждения) в области анализа и диафрагмирования флуоресцентного излучения в плоскости изображения. Такое увеличение контрастности приводит к возможности разрешения объектов, имеющих разницу в интенсивности до 200:1, а также обеспечивает повышение разрешения, как в плоскости объекта, так и вдоль оптической оси. Наряду с повышением контрастности флуоресцентная конфокальная микроскопия позволяет обеспечивать пошаговую трехмерную реконструкцию исследуемого объекта за счет использования многоточечной подсветки. Среди наиболее передовых методик сканирующей конфокальной микроскопии следует выделить использование сканирующего диска с микродиафрагмами и применение матричных фотодетекторов .

На сегодня существуют методы, которые позволяют значительно повысить разрешающую способность конфокального микроскопа. В обычном конфокальном микроскопе возбуждающий свет фокусируется в одну точку на образце с последующей детекцией эмиссионного флуоресцентного сигнала. Эмиссионное излучение вне фокуса отсекается пинхолом (точечной диафрагмой), размер которого определяет, сколько максимумов диска Эйри достигнет детектора. Увеличения разрешения можно добиться за счет уменьшения диаметра диафрагмы (пинхола), но соотношение «сигнал-шум» при этом значительно снизится за счет уменьшения интенсивности проходящего через диафрагму эмиссионного излучения. Альтернативой такому сканированию является использование матричных детекторов[42][43], которые одновременно регистрируют распределение интенсивности вдоль латеральной плоскости образца одновременно со всей площади диска Эйри, где каждый фоточувствительный элемент выполняет функцию пинхол апертуры. Так, с использованием алгоритма детекции 32-канальным матричным детектором (Airyscan[44][45]), была показана возможность превышения предела классического разрешения (дифракционного предела) более чем в 1,7 раза во всех трех измерениях: до 140 нм латерально и 400 нм аксиально при длине волны 488 нм[46][47][48][49][50][51][52].

КЛСМ широко используется практически во всех отраслях биологии, от клеточной биологии и генетики до микробиологии и биологии развития. Она также используется в квантовой оптике и нанокристаллической визуализации и спектроскопии.

Биология и медицина

В клиническом плане, КЛСМ используется для исследования различных заболеваний глаз, и особенно для визуализации, качественного анализа и количественной оценки эндотелиальных клеток роговицы[53]. Он используется для локализации и идентификации присутствия нитевидных грибковых филаментов в строме роговицы в случаях кератомикоза, что обеспечивает быструю диагностику и раннее введение корректной терапии. Также представляется перспективным проведение методом КЛСМ эндоскопических процедур (эндомикроскопия)[54]. В фармацевтической промышленности было рекомендовано с помощью данного подхода отслеживать процесс производства тонкопленочных фармацевтических форм, контролировать качество и однородность распределения лекарственных субстанций.

Оптика и кристаллография

КЛСМ используется как механизм восстановления данных в некоторых 3D-оптических системах хранения данных или картировании химических соединений, а также в физике полупроводников и спинтронике (в частности, в изучении свойств NV-центров).[55][56].

• 
  Серия конфокальных изображений (z-стек), демонстрирующих распределение актиновых филаментов в клеточной линии остеосаркомы U2OS
• 
  3D реконструкция серии конфокальных изображений ядра фиксированных клеток линии HeLa, трансгенный химерный белок гистон H2B-GFP
• 
  β-тубулин в инфузории Tetrahymena
• 
  Срез листа Pteridium aquilinum
• 
  Конфокальное изображение поперечного среза стебля Lycopodium annotinum
• 
  Поперечный срез листа Dryopleris filix-mas
• 
  Конфокальное изображение фрагмента монеты «1 евро»
• 
  Двухканальное конфокальное изображение митотических микротрубочек

• Оптическая микроскопия
• Флуоресцентная микроскопия
• Флуоресцентная наноскопия
• Флуоресценция в биологических исследованиях
• Лазерная микроскопия

• Molecular Expressions: Laser Scanning Confocal Microscopy
• Nikon’s MicroscopyU. Comprehensive introduction to confocal microscopy.
• Emory’s Physics Department. Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
• The Science Creative Quarterly’s overview of confocal microscopy — high res images also available.
• Programmable Array Microscope (недоступная ссылка) — Confocal Microscope Capabilities.
• OPTELICS HYBRID — многофункциональный световой конфокальный и лазерный конфокальный микроскоп .