Далтон, Говард

Исследовательская карьера Говарда началась с работы над докторской диссертацией в университете Сассекса под руководством профессора Джоном Постгейтом (член Королевского общества с 1977) на дуговой установке фиксации азота. Он изучал фиксацию азота в аэробной почвенной азотобактерии. Эта докторская диссертация была защищена в 1968 году. При бактериальной азотфиксации, атмосферный азот восстанавливается до аммиака в реакции, катализируемой комплексом нитрогеназы, который состоит из двух белков, содержащих такие металлы как железо и молибден. Высокая чувствительность этого фермента к кислороду легла в основу главного вопроса докторской диссертации Далтона: как кислородчувствительная нитрогеназа действует в бактериях в высоко аэробной окружающей среде? Его обширное, творческое исследование отчетливо показало, что эта проблема может быть объяснена с помощью двух механизмов: во-первых, дыхательная защита, при которой дыхание использовалось для того, чтобы продувать кислород вниз к безопасным уровням, и во-вторых, конформационное предохранение, в котором изменения конформации фермента защищают чувствительные к кислороду участки[5].

В 1968 г. Далтон на два года переехал в США для сотрудничества с профессором Лэн Мортэнсен в Университете Пердью, Индиана, для изучения биохимии нитрогеназы в анаэробной бактерии Clostridium. Эта работа расширила его познания в очистке белков, спектрофотометрическом анализе и спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) ферментов металлов в сложных многопротеиновых системах. Эти исследования способствовали развитию его последующей работы по окислению метана.

Метилотрофы — это микробы, способные расти на восстановленных углеродных соединениях, содержащих один или несколько атомов углерода, но не содержащих углерод-углеродных связей; примерами таких веществ являются метан, метанол, метиламин и триметиламин[6]. Конечным продуктом всей анаэробной микробной деградации органического материала является метан. Часть его достигает атмосферы, где он является мощным парниковым газом. Метанотрофы представляют собой основную группу метилотрофов, способных использовать метан и, следовательно, играют важную роль в углеродном цикле, уменьшая количество метана, высвобождаемого в атмосферу. Они приобрели важное значение, поскольку могут использоваться в процессах биотрансформации и биоремедиации. Метанотрофы разделяют на тип I и тип II[7]. Первоначально это разделение было основано на их внутренних мембранных системах, но типы метанотрофов также различаются по их способам ассимиляции углерода, генетическим системам, филогении и т. д.

Говард собрал большую исследовательскую группу в университете Уорвика и руководил работой, посвященной чрезвычайно сложному процессу, при котором метан окисляется до метанола при воздействии мителотрофов. Это первый необходимый шаг для последующего производства энергии и ассимиляции углерода в новых клетках. Вся энергия, используемая для роста метанотрофов, образуется при окислении метана до углекислого газа:

CH₄ → CH₃OH → HCHO → HCOOH → CO₂.

В 1973 году первый этап этого процесса практически не был изучен. Далтон решил начать его изучение, используя данные, полученные при работе над многокомпонентными металлосодержащими ферментными системами, которые он получил во время своего исследования нитрогеназы и связанных с ней ферментами. Он успешно достиг своей цели вместе со студентами-исследователями и профессорами, в первую очередь Джоном Колби и Дэвидом Стерлингом. Совместная работа многих лабораторий с использованием различных метанотрофов привела к общему выводу: первая стадия окисления метана катализируется смешанной системой монооксигеназы. Теперь это называется метанмонооксигеназой (MMO); именно она гидроксилирует метан в метанол с использованием молекулярного кислорода и восстановителя (AH₂):

CH₄ + AH₂ + O₂ → CH₃OH + H₂O + A.

Предполагалось, что восстановитель является обычным метаболическим восстановителем, NADH или NADPH, но в более ранних исследованиях существовала значительная путаница и разногласия этих результатов, что часто было связано с использованием различных бактерий, мембранных препаратов и ферментных анализов. Явные системы анализа включили бы спектрофотометрическое измерение исчезновения NADH, или метан-зависимого и NADH-зависимого от потребления кислорода. Однако в большинстве бесклеточных препаратов используются мембранные фракции, содержащие NADH-оксидазу, которая также потребляет NADH и кислород, и продукт метанола также может быть дополнительно метаболизирован.

Существенным первым шагом Далтона в решении проблемы была разработка надежных, однозначных систем анализа; Созданные им системы используются до сих пор. В них не используется очевидный субстрат (метан), но в основе лежит использование альтернативных алканов, окисление которых ММО зависело от его исключительно широкой субстратной специфичности[8]. Эти методы включают окисление бромметана, исчезновение которого возможно измерить с помощью газово-жидкостной хроматографии (ГЖХ), и окисление этилена или пропилена, продукты эпоксидной смолы также измеряются методом ГЖХ.

Применение этих методов привело к окончательному описание ММО, используя фермент, очищенный от растворимых экстрактов метанотрофов типа I Methylococcus capsulatus штамма Бата. Первоначально он был выделен Роджером Уиттенбери из горячих источников римских бань в Бате. Впоследствии эта растворимая MMO (sMMO) присутствовала в нескольких метанотрофах. Как показало исследовани, она катализирует гидроксилирование метана в метанол, с NAD(P)H в качестве восстановителя. Состоит она из трех компонентов и, как и нитрогеназа, содержит ионы металлов. Разложение этого фермента на входящие в его состав белки было значительным достижением, поскольку только один из компонентов мог быть проанализирован независимо от двух других. Этот компонент С теперь известен как редуктаза, флавопротеин, содержащий FAD, и центр сульфида железа, который содержится в ферредоксине шпината и путидаредоксине. Компонент А представляет собой гидроксилазу и содержит негемоглобинное железо. Компонент B, связывающий белок, представляет собой небольшой бесцветный белок.

Компонент C переносит электроны от донора NADH к гидроксилазе, которая катализирует метановый субстрат с использованием молекулярного кислорода. Примерно в это же время Джон Хиггс и его коллеги смогли сделать работу по частичной очистке трехкомпонентной ММО[9] из мембран метанотрофа II типа, methylosinus trichosporium. Донором электронов в необработанных препаратах был NADH, но в очищенных препаратах необходимо было использовать аскорбат или цитохром компонента С. Полученный фермент относительно нестабилен, вследствие чего некоторые результаты не всегда легко воспроизвести. Таким образом казалось, что могут существовать два разных типа MMO или что в обоих типах метанотрофа может быть одна мембранная MMO с условием, что она может быть легче высвобождена из ее связи с мембранами для получения sMMO.

Эта путанность в конечном итоге была решена группой Далтона в исследовании, использующем выращивание штамма бактерий. Было показано, что существуют два совершенно различных ферментов в Methylococcus capsulatus в sMMO, а также мембранная (или частичная) ММО (pMMO). Вид выработанного фермента зависит от наличия меди: pMMO образуется, когда соотношение медь: биомасса высокое, тогда как sMMO — когда соотношение медь: биомасса низкое[10]. В группе культур бактерий могут производиться оба ММО, так как соотношение медь: биомасса не может быть такой же контролируемой или определенной (изучение роли меди в метанотрофах[11].).

Впоследствии группа Далтона разработала воспроизводимые методы солюбилизации и очистки и показала, что связанный с мембраной фермент pMMO также имеет три компонента, а также что два типа MMO присутствуют в других метанотрофах независимо от типа мембраны. Некоторые метанотрофы синтезируют только один тип ММО, и в этом случае чаще всего образуется мембранный фермент. Примечательно, что два семейства MMO не имеют обнаруживаемого сходства в аминокислотной последовательности или трехмерной структуре.

Отличительной особенностью ММО, возможно, связанной с их нормальным небольшим нефункционализированным метановым субстратом, является их чрезвычайно широкая субстратная специфичность. Так sMMO имеет более широкий диапазон субстратов, чем pMMO. Субстраты для sММО включают Н-алканы, Н-алкены, хлорметан, бромметан, трихлорметан, нитрометан, метанол, окись углерода, диметиловый эфир, бензол, стирол и пиридин[12]. Этот фермент способен окислять аммиак, структура которого явно аналогична структуре метана.

Когда используются целые клетки, в дополнение к потенциальному субстрату также должен быть предусмотрен восстановитель (например, метанол или формиат). В некоторых случаях окисление потенциального субстрата называется соокислением.

Дальтон показал, что, поскольку метанотрофы могут совместно окислять ряд углеводородов и хлорированных загрязнителей, они представляют биотехнологический интерес, далеко выходящий за рамки их способности к окислению метана до метанола[13]. Важными примерами являются промышленное производство метанола из метана, совместное окисление пропена до эпоксипропана, биоремедиация хлорированных углеводородов и получение ценных рекомбинантных белков с использованием метана в качестве исходного материала.

Интерес Говарда к биотрансформациям и полученные знания в данной области помогли ему стать консультантом компании Нью-Джерси Celanese, а затем присоединиться к научно-консультативному совету для спин-биотехнологической компании Celgene, где он продолжил изучать химические и промышленные аспекты микробиологии.

Широкая субстратная специфичность метановых монооксигеназ позволила использовать их в качестве катализаторов сложных химических реакций, которые могли бы привести к получению полезных материалов. Хотя более ранняя работа Говарда Далтона в Уорвике была в значительной степени основана на монооксигеназах метана, после 1986 года он больше занимался изучением других типов оксидоредуктаз. Его главным коллегой по этим исследованиям стал Дерек Бойд из Королевского университета Белфаста. Их плодотворное сотрудничество в области химической микробиологии длилось 20 лет. При этом их работы получили совместные награды от британских исследовательских Советов, программ Европейского Союза, а также промышленности, которые финансировали все проекты по химическому каталитическому синтезу в Уорвике и Белфасте.

Говард Далтон совместно с Дереком Бойдом опубликовали 42 совместные публикации и создали 3 патента.

В начале своего сотрудничества в 1986 год они приняли решение, что, поскольку спрос на хиральных синтоны возрастает как в академической, так и в промышленной сфере, важные цели их исследований должны включать в себя:

1. Разработку надежных методов распределения структуры и стереохимии метаболитов,
2. Открытие новых типов метаболитов цис- и трансдигидродиола,
3. Исследование потенциально конкурирующих реакций, катализируемых толуолдиоксигеназой,
4. Оценка новых применений хиральных метаболитов в химическом синтезе, включая хиральные лиганды.

Большинство биотрансформаций были проведены и проанализированы в университе Уорвика, после чго их транспортировали в университет Белфаста для химического анализа.

Дальнейшие исследования Говарда метановой монооксигеназы развивались в сотрудничестве с другими учеными.

После очистки и проведенной характеристики двух основных типов монооксигеназы метана, основной проблемой являлась молекулярная биология их синтеза и регуляции. Этот аспект был рассмотрен и разработан в отделе Говарда Колином Мюрреллом[14]. Другая важная задача заключалась в объяснении их механизмов и трехмерных структур.

Структура растворимого фермента в основном определялась группой ученого Липпарда[15].

В 1983 году школа биологических наук учредила степень микробиологии и микробной технологии, и Говард, вместе со своим бывшим аспирантом Колином Мюрреллом, который вернулся на кафедру в этом же году в качестве преподавателя, сыграл важную роль в разработке этого инновационного курса, одного из первых в своем роде в Великобритании. Его популярность возрастала в течение следующих 10 лет, подготавливая новое поколение микробиологов, которые были хорошо знакомы с использованием микробов (особенно метанотрофов) в области биотехнологии.

В 1980 году Родом Куэйлом и его коллегами был организован симпозиум в Шеффилде, где Говард редактировал свои научные труды[16]. 12 лет спустя вместе со своими коллегами из департамента он отвечал за седьмой симпозиум, проведенный в Университете Уорвика[17]. Говард сильно изменил организацию этих симпозиумы своим непосредственным научным вкладом в них.